生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

Summary

この手順では、刺激により活発に分泌するIL – 17マウスTh17細胞の白血球の検出と分離を説明します。

Abstract

MACSサイトカイン分泌アッセイ技術は、単一細胞レベルと実行可能なサイトカイン分泌細胞の高感度分離に分泌されたサイトカインを検出することができます。 IL – 17分泌細胞を標識するためには、マウス脾細胞の単一細胞の懸濁液を37に調製し、刺激°回転PMA /イオノマイシンとCは、サイトカイン分泌を誘導する。停止するには分泌細胞は、氷の上に配置され、IL – 17キャッチ試薬には、細胞表面の近くに分泌され、捕捉されたとして、白血球の細胞表面上のCD45に特異的に結合し、IL – 17に二重特異性抗体を公開されています。分泌は、その後、温度を37増加させることによって再起動され° CとIL – 17がキャッチ試薬によってトラップされる。分泌は、その後、氷上で細胞を配置することにより、再び停止されます。トラップされたIL – 17を検出するために、細胞はビオチンに結合した第二のIL – 17特異的抗体とAnti – Biotin – PE抗体とインキュベートされています。セルが、直接、フローサイトメトリーによって分析またはAnti – PEコンジュゲートマイクロビーズと、その後の標識によって分離と濃縮のために調製することができる。

Protocol

試薬の準備 BSAを含むPBS（0.5％）、および2mM EDTAを含むバッファーを加えます。気泡は、MACS分離カラムをブロックすることができるため、バッファーは2〜8℃使用前に脱気し、格納する必要があります。 我々は、5％のマウス血清を含むRPMI 1640培地を使用してください。培地は、これらの化合物が細胞刺激の特異性を変えてしまうように、BSAまたはFCSを含めてはいけません。 マウスIL – 17 Secretion Assayは – ミルテニーバイオテク-から細胞分離キット。 IL – 17キャッチ試薬、IL – 17検出抗体（ビオチン）、抗ビオチン- PE、およびAnti – PE MicroBeadsは：キットには、次のコンポーネントが含まれています。 脾細胞を刺激するこのプロトコルは、このような非刺激脾細胞とT細胞のための対比として、陰性と陽性対照の存在下で行われる。このプロトコルは、無菌操作を用いて行われる。 gentleMACS™のDissociatorを用いて分離されたマウスの脾細胞の単一の細胞懸濁液を準備します。細胞の濃度は、細胞計数を介して所定の必要があります。室温で10分間、200 × gでペレットは、細胞。 遠心分離に続いて、ピペットを用いてペレットから上清を吸引除去する。ペレットの損失を避けるためにチューブをデカントしてください。 今、培地中の細胞を再懸濁し、その後ウェルに加える。 mLのごとに10万セルと平方センチメートルあたり5万個の細胞の濃度に対して十分なメディアを追加。 私たちの再懸濁した細胞の免疫応答を刺激するために、我々は、サンプルにイオノマイシン（1μg/ mLの）とPMA（10 ng / mL）を加え、穏やかにピペッティングして混合液を。その後、井戸はそれに応じてラベルが付いています。 今、我々は37℃で3時間、私たちの細胞をインキュベートする予定° C刺激期間を開始するためにないミキシングを持つ。刺激の開始からのIL – 17の分析3時間に進みますので、それに応じて計画しています。 分泌を停止するには、細胞を氷の上に置き、我々は静かに冷緩衝液をピペッティングによって刺激された細胞を収集している。次いで、細胞をウェルからのチューブに移していると二回目を洗浄しています。 すべてのセルが収集されることを保証するために、それは顕微鏡下でお皿をチェックすることをお勧めします。細胞がまだ接続されている残っている場合には、冷緩衝液で皿を洗浄することにより、残りの細胞を収集することができます。あなたの細胞懸濁液内の任意のセルの塊は、事前に分離フィルタを使用して削除できます。 キャッチ試薬で細胞をラベリングそれは、IL – 17分泌細胞の2％未満が存在する場合、このアッセイは最適に動作することを、注意することは重要です。 IL – 17分泌細胞の濃度はそれに応じてボリュームを調整する2％を超えると予想される場合。 この手順の1つの潜在的な落とし穴は、それによって偽陽性を生成する、隣接するリンパ球から分泌される。二重特異性抗体は、非分泌性T細胞とトラップに結合するIL – 17を標識する際に発生する可能性がキャッチ試薬のクロスコンタミネーション、です。 この問題を回避するためには、それはダウン前の冷緩衝液でラベリングや仕事へのIL – 17の拡散を遅くし、このクロスコンタミネーションを避けるために、細胞を冷却することが重要です。細胞は冷たい保つことに加え、それらは定義されている濃度に保たれている必要があります。 ラベリングの手順を開始するには、我々は、15ミリリットル閉鎖可能なチューブに10万セルを使用してください。高い細胞数を使用するがある場合は、単にそれに応じてすべてのボリュームをスケールアップ。最適な細胞濃度が取得された後、冷緩衝液10mlを添加することにより細胞を洗浄。 冷却遠心機（2〜8℃）で10分間、300 × gで細胞をスピンダウン。 遠心分離に続いて、完全にピペットを用いて上清を吸引除去する。これは、セルの損失や不正確なボリュームにつながるとして、上清をデカントしてください。コー​​ルドバッファ、遠心分離、そして吸引10mlのを追加することで構成され、洗浄ステップを繰り返します。 今我々は、所望の純度のペレットを持っていることを、冷たい培地80μLに細胞を懸濁します。それらにラベルを付けるには、我々は今マウスIL – 17キャッチ試薬20μLを追加します。 氷上で5分間細胞をインキュベート。 氷上で5分間のインキュベーション期間の後、チューブを取り外し、37℃の暖かい培地10 mlに細胞を希釈する。その後MACSmixチューブローテーター上にチューブを固定し、37チューブをインキュベート° Cを連続的に動きの下で45分間。温度を37増加させると、° Cは、サイトカインの分泌を再起動します。 IL – 17検出抗体（ビオチン）とAnti – Biotin – PEと細胞のラベリング 37℃で45分間の分泌期間の後、氷上ですぐにチューブを置きます。これは、サイトカインの分泌を停止します。ここからその上に氷の上で細胞を維持することが重要です。コー​​ルドバッファを操作するキャッチ試薬のクロスコンタミネーションを避けることができます。 2〜8℃で300xgで冷緩衝液および遠心機でチューブを埋める℃で10分間。完全に上清を吸引除去する。洗浄工程の1つのより多くの時間を繰り返します。 細胞ペレットを冷緩衝液80μLに再懸濁され、チューブを氷上に配置されます。 抗体の非特異的な結合を避けるために、我々は、5分間氷上で10μlをのFcRブロッキング試薬とインキュベートの追加をお勧めします。その後、我々は、氷上で10分間、ビオチンとインキュベートする共役であるマウスIL – 17検出抗体（ビオチン）の20μLを加える。 我々は2〜8℃で300xgでコールドバッファと遠心10mLを加えることによって前に行っているので、再度、細胞を洗浄℃で10分間。 今すぐ上清を吸引し、冷バッファー80μlで細胞ペレットを再懸濁します。 私たちの二次抗体、抗ビオチン- PEの20μLを追加。 細胞および二次抗体溶液を混合し、再び氷上で10分間チューブをインキュベートする。 この2回目のインキュベーションが完了したら、10 mLの冷緩衝液および遠心で細胞を洗浄する。 ペレットは現在、冷緩衝液500μlで再懸することができます。 細胞はさらに下流の分析のために分離する必要がある場合、それらは磁気抗PE – MicroBeadsで標識し、MACSカラムとMACSのセパレーターを使用して手動または自動分離することができます。 我々は現在、脾細胞のラベリングを完了し、分析のために準備が整いました。 FACS解析我々の分析では、フローサイトメトリーにより刺激と刺激脾細胞を比較します。 フローサイトメトリー分析の前に、細胞が死細胞外ゲートに0.5μg/ mlで、ヨウ化プロピジウムで染色されています。 MACSQuant™アナライザーは、サンプルごとに20万セルにロードされており、我々は現在、サンプル中の相対的な抗体の反応性の散布図を見に行くされています。希少細胞の解析のための2つの重要な考慮事項 – IL – 17陽性細胞のような – フローサイトメトリーでは、次のとおりです。 前方散乱対側の散布図でリンパ球にゲートを設定と死細胞（ヨウ化プロピジウムで染色）およびB -細胞（非特異的バックグラウンド染色を引き起こす可能性があります）をゲーティングは、さらに検出感度を高めるために我々はT細胞とB細胞を検出するためにCD45R/B220-PerCP抗体を検出するためにCD4 – APC抗体を使用。我々は、試料の前方および側方散乱の特性を参照してくださいとリンパ球集団にゲートを適用します。 秒のゲートは、染色した死細胞と染色したB細胞（Y軸）を参照に適用した。これらの細胞は、T細胞の解析から除外されます。 約0.003％（図4） – この例では、基本的に私たちのネガティブコントロールである、我々は非常に少数のIL – 17刺激を受けていない試料の分泌CD4陽性T細胞があることがわかります。 0.367％程度（図5A）分離前とMACS技術（図5B）と磁気分離後の60.76パーセント – 刺激T細胞集団を見ると、我々はその分泌IL – 17 CD4陽性T細胞のかなりの数を見ることができます。

Discussion

Th17細胞は適応免疫と炎症反応において重要な役割を果たし、自己免疫炎症を推進する上で重要なコンポーネントです。

細胞分離キット（PE） – 国内でのみ有効のマウスIL – 17 Secretion Assayは使用方法をこのビデオドキュメント。この手順を行うときには、出発細胞調製物におけるIL – 17分泌細胞の頻度の推定をすることが重要です。ラベリングおよびサイトカイン分泌の期間中に適切な細胞濃度は懸濁状態で他の細胞によるクロスコンタミネーションを防ぎ、信頼性の高い結果を保証します。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE)	Reagent	Miltenyi Biotec	130-094-213	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx
RPMI 1640	Medium	Miltenyi Biotec	130-091-440	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx
CD4-APC	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-611	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx
CD8a-FITC	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-605	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx
Propidium Iodide Solution	Reagent	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
FcR Blocking reagent, mouse	Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx
Dead Cell Removal Kit	Reagent	Miltenyi Biotec	130-090-101
MACSmix Tube Rotator	Instrument	Miltenyi Biotec	130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
gentleMACS™ Dissociator	Instrument	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
autoMACS Pro Starting Kit	Instrument	Miltenyi Biotec	130-092-545	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx
MACS Columns	Tool	Miltenyi Biotec		http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx
MACS Separator	Tool	Miltenyi Biotec