Foto-Induzida Cross-Linking de Proteínas Unmodified (picup) Aplicada à Peptídeos amiloidogênicas

Resumo

Foto-induzida ligação cruzada de proteínas não modificadas (picup) permite a caracterização da distribuição de tamanho de oligômero em misturas de proteínas metaestável. Demonstramos aplicação de picup a três peptídeos representante amiloidogênicas a 40 - e 42 resíduos de formas de amilóide β-proteína, e calcitonina, peptídeo e um controle do fator de crescimento hormônio liberador.

Resumo

O conjunto de proteínas amiloidogênicas em oligômeros tóxicos é um evento seminal na patogênese de doenças proteína misfolding, incluindo Alzheimer, Parkinson e doenças de Huntington, esclerose amiotrófica hereditária lateral, e diabetes tipo 2. Devido à natureza metaestável destes conjuntos de proteínas, é difícil avaliar a sua distribuição de tamanho de oligômero quantitativamente usando métodos clássicos, tais como eletroforese, cromatografia de espalhamento de luz, fluorescência, ou dinâmico. Oligômeros de proteínas amiloidogênicas existir como misturas metaestável, em que os oligômeros se dissociam em monômeros e associar em conjuntos maiores simultaneamente. Picup estabiliza populações oligômero por covalente cross-linking e quando combinado com métodos de fracionamento, como eletroforese em gel de sulfato de sódio dodecil de poliacrilamida (SDS-PAGE) ou tamanho-exclusão cromatografia (SEC), picup fornece instantâneos das distribuições de tamanho de oligômero que existia antes de cruz -linking. Assim, picup permite a visualização e análise quantitativa das populações de proteína metaestável e pode ser usado para monitorar a montagem e decifrar as relações entre modificações seqüência e oligomerização

Protocolo

1. Preparação de peptídeos

1. Pesar ~ 100-200 mg de peptídeo liofilizado usando uma microbalança e transferência para rotulados, revestido a silicone, tubos de microcentrífuga de baixa adsorvente. Aqui, nós usamos seqüências de humanos de Aβ40, Aβ42, calcitonina e GRF.
2. Aqui, usamos peptídeos pré-tratados com 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obter homogênea, agregar-free preparativos. Esta etapa é necessária porque pré-formados agregados induzir a agregação rápida de proteínas amiloidogênicas, que resultam em reprodutibilidade pobres entre os experimentos ^5. Outros métodos, como a filtração ea SEC também pode ser usado para ob....

Discussão

Picup foi desenvolvido originalmente para estudar complexos de proteína estável ^2. O método foi aplicado mais tarde para estudo quantitativo de assembléias amilóide metaestável proteína, incluindo Aâ ^10, prion e doenças associadas ao PrP ^{Sc 11,} e α-sinucleína ^12. Os fatores mais importantes que devem ser considerados ao projetar um experimento picup estão a estequiometria reagente, tempo de irradiação, eo procedimento de preparação da amostra. As duas primeiras questões podem exigir otimização emp.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lâmpada incandescente Dolan-Jenner de 200 W	Outro	Dolan-Jenner Industries	Modelo 170-D	O calor gerado pela lâmpada d–s não afeta as amostras em períodos curtos de incubação.
Corpo de câmera SLR de 35 mm	Ferramenta	Pentax	Modelo SP500	Em nossa configuração, um fole é acoplado ao corpo da câmera para fornecer uma câmara conveniente para irradiação da amostra colocada a 10 cm da fonte de luz.
Tubos PCR transparentes e de parede fina	Outro	Eppendorf	951010006 fornecido pela Fisher L22-003-24
Frascos de vidro (1,8 mL)	Outro	Kimble Chase	60940A 2, fornecido pela Fisher 03-340-60
GRF	Reagente	Bachem	H-3695
HFIP	Reagente	TCI America	H0424	Utilizar em capela de exaustão.
Aβ40 e Aβ42	Reagente	Laboratório de Biopolímeros da UCLA
Calcitonina	Reagente	American Peptide	22-1-10
Tris(2,2-bipiridil)diclororutênio(II) hexaidratado	Reagente	Sigma-Aldrich	224758-1G	Vortex até a solução ficar límpida. Cubra o tubo de RuBpy com papel alumínio para proteger o reagente da luz ambiente. O RuBpy é preparado fresco a cada uso e deve ser utilizado dentro de 48 h.
Persulfato de amônio	Reagente	Sigma-Aldrich	A-7460	Vortex até a solução ficar límpida. O APS é preparado fresco a cada uso e deve ser utilizado dentro de 48 h.
β-mercapto–etanol	Reagente	Sigma-Aldrich	M7154-25 mL	Pode ser usado quando é realizada a análise por SDS-PAGE.
Tampão amostral Novex Tricina SDS (2x)	Reagente	Invitrogen	LC1676
Célula Mini XCell SureLock	Ferramenta	Invitrogen	EI0001
Géis Novex Tricina (10-20%)	Outro	Invitrogen	EC6625B0X
Tampão de corrida Novex Tricina SDS (10x)		Invitrogen	LC1675
Kit de Coloração Silver Express		Invitrogen	LC6100