Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina
Summary
Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten.
Abstract
Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Allerdings sind viele der retinalen Nervenzellen, wie Amakrinzellen, erweitern ihre Dendriten horizontal, so dass die Morphologie der Zellen soll zu stark in den vertikalen Scheiben beschädigt werden. In der ganzen-mount Vorbereitung, insbesondere für Patch-Clamp-Aufnahmen sind Netzhautneuronen in der mittleren Schicht nicht leicht zugänglich durch die umfangreiche Berichterstattung von Gliazellen (Mueller-Zelle) s endfeets. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten. Die Scheibe wurde horizontal an der inneren Schicht der Netzhaut mit einem Vibratom Allesschneider gemacht, nachdem der Netzhaut in der Tieftemperatur-Agarose-Gel eingebettet war. In diesem horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut, untersuchten wir die Funktion der Netzhaut Neuronen im Vergleich zu ihrer Morphologie, mit Patch-Clamp-Aufzeichnung, Kalzium-Imaging-Technik, Immunzytochemie und Einzelzell-RT-PCR.
Protocol
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Vorteile der horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut.
Zunächst wird die Morphologie der Zellen, die Dendriten erweitern horizontal wie Amakrinzellen und horizontale Zellen, erhalten. Es hat sich gezeigt, dass es über 20 Arten von Amakrinzellen in der Netzhaut (MacNeil und Masland, 1998), so dass es ganz wichtig ist, die Morphologie der Zellen mit der physiologische Eigenschaft zu vergleichen.
Zweitens, in der ganzen-mount Netzhaut verhindert, dass die umfangreiche Berichterstattung von Gliaz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs. Richard H. Masland und Akimichi Kaneko, dass sie uns wertvolle Hinweise und Anregungen an das Verfahren der horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut zu etablieren.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agar | Sigma | A-1296 | ||
| Agarose L | Wako | 317-01182 | Low-temperature melting agarose | |
| Hyaluronidase | Sigma | Type I-S, 300 units/mg | ||
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | |||
| Microwave | ||||
| Hot water bath | 35 C | |||
| Vibratome slicer | Leica | VT1000S | ||
| MF-Membrane filters | Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 um | |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | |||
| Instant glue | eg., Alonalpha, Krazy Glu | |||
| 50 ml syringe | ||||
| syringe filter | Millipore | SX0001300 |
Referências
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A., Koizumi, A., TC, J. a. k. o. b. s., Masland, R. H., MA, M. a. c. N. e. i. l., RH, M. a. s. l. a. n. d. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
