Tradicionalmente a fatia vertical e toda a preparação para montagem da retina têm sido usados para estudar a função dos circuitos da retina. Aqui, descrevemos a novela corte método para preservar a morfologia dendrítica de neurônios da retina intacta.
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Artigo de método
Preparação Slice horizontal da Retina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tradicionalmente a fatia vertical e toda a preparação para montagem da retina têm sido usados para estudar a função dos circuitos da retina. No entanto, muitos dos neurônios da retina, tais como as células amácrinas, expandir as suas dendrites horizontalmente, de modo que a morfologia das células é suposto ser severamente danificado nas fatias verticais. Em toda a preparação de montagem, especialmente para patch-clamp gravações, os neurônios da retina na camada do meio não são facilmente acessíveis devido à extensa cobertura de células gliais endfeets (célula Mueller) s. Aqui, descrevemos a novela corte método para preservar a morfologia dendrítica de neurônios da retina intacta. A fatia foi feito horizontalmente na camada interna da retina usando um cortador de vibratome após a retina foi incorporado na baixa temperatura de fusão agarose gel. Nessa preparação fatia horizontal da retina, estudamos a função dos neurônios da retina comparado com sua morfologia, usando patch-clamp gravação, técnica de imageamento de cálcio, imunocitoquímica, e de uma única célula RT-PCR.
Protocolo
- Prepare um bloco de agar (30 mg / ml, ou seja 3%, em água destilada). Dissolver e microondas-lo primeiro e coloque em uma travessa de vidro. Mantenha o prato no frigorífico a 4 º C.
Dica: O bloco de ágar deve ser preparado com antecedência.
- Prepare baixa temperatura de fusão-agarose gel (25 mg / ml, ou seja, 2,5%, em média). Dissolver e microondas. Mantê-lo no banho de água quente a 35 o C.
Dica: Mantenha o gel agarose não muito quente. Se for muito quente, ele leva muito tempo a ser solidificado, e que o gel pode matar a retina
. - Eutanásia do animal enuclear, um globo ocular e abri-l....
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Discussão
Existem várias vantagens importantes da preparação fatia horizontal da retina.
Primeiro, a morfologia das células que se expandem horizontalmente dendrites, como as células amácrinas e células horizontal, é preservada. Tem sido demonstrado que há mais de 20 tipos de células amácrinas na retina (MacNeil e Masland, 1998), de modo que é muito importante para comparar a morfologia das células com a propriedade fisiológica.
Em segundo lugar, em toda a retina de montagem, a extensa cobertura do endfeets células gliais s impede o a.......
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Divulgações
Todos os protocolos experimentais foram conduzidos de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para uso animal.
Agradecimentos
Agradecemos a drs. Richard H. Masland e Akimichi Kaneko por nos dar conselhos e sugestões valiosas para estabelecer o procedimento da preparação fatia horizontal da retina.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Agarose de baixo ponto de fusão |
| Hialuronidase | Sigma-Aldrich | Tipo I-S, 300 U/mg | |
| Meio | em mM: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl2, 1,0 MgCl2, 23 NaHCO3 e 10 glicose, mantido em pH 7,8, ou Solução de Ames’ (Sigma) | ||
| Microndas | |||
| Banho-maria | 35 °C | ||
| Cortador vibratômico | Leica Microsystems | VT1000S | |
| Filtros de membrana MF | EMD Millipore | HAWP01300 | Papel filtro, tamanho de poro 0,45 µm |
| Ferramentas de dissecação | pinceta, lâmina, pinça, tweezers, etc. | ||
| Cola instantânea | ex. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| Seringa de 50 mL | |||
| Filtro para seringa | EMD Millipore | SX0001300 |
Referências
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H.
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Reimpressões e permissões
