समुद्री माइक्रोबियल पर्यावरण Transcriptomics का उपयोग कर समुदाय से जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण
Summary
हम पर्यावरण mRNA से सीडीएनए पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. सामान्य में, कुल शाही सेना पहले पर्यावरण से एकत्र किया जाता है, rRNA चुनिंदा, हटा दिया जाता है mRNA चुनिंदा परिलक्षित होता है, और समृद्ध mRNA पूल से संश्लेषित सीडीएनए अनुक्रम है. बरामद दृश्यों एनोटेट मानक जैव सूचना विज्ञान तकनीक का उपयोग करने के लिए व्यक्त जीनों की पहचान कर सकते हैं.
Abstract
Metagenomics के अनुरूप पर्यावरण (metatranscriptomics) transcriptomics retrieves और जीन क्या समुदाय व्यक्त हो सकता है के पूर्व ज्ञान के बिना एक सूक्ष्म संयोजन से पर्यावरण mRNAs दृश्यों. इस प्रकार यह समुदाय जीन अभिव्यक्ति पर सबसे निष्पक्ष परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है<em> बगल में</em>. पर्यावरण transcriptomics प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से कठिन हैं के बाद से prokaryotic mRNAs आमतौर पाली (ए) पूंछ है कि यूकेरियोटिक संदेश के अलगाव की कमी अपेक्षाकृत सरल<sup> 1</sup> और क्योंकि mRNAs का अपेक्षाकृत कम आधा जीवन के<sup2></sup>. इसके अलावा, mRNAs कम कुल शाही सेना के अर्क में rRNAs की तुलना में प्रचुर मात्रा में हैं, इस प्रकार एक rRNA पृष्ठभूमि अक्सर mRNA संकेतों पड़ा. हालांकि, इन कठिनाइयों के कुछ काबू पाने के लिए तकनीक हाल ही में विकसित किया गया है. क्लोन का उपयोग कर यादृच्छिक प्राइमरों रिवर्स नक़ल और पर्यावरण mRNAs बढ़ाना पुस्तकालयों बनाने द्वारा पर्यावरण transcriptomes विश्लेषण करने के लिए एक प्रक्रिया है हाल ही में वर्णित था दो विभिन्न प्राकृतिक वातावरण में सफल है, लेकिन परिणाम यादृच्छिक सीडीएनए संश्लेषण आरंभ किया प्राइमरों के चयन से पक्षपाती थे<sup> 3</sup>. MRNA की रैखिक प्रवर्धन में अग्रिम प्रवर्धन चरण में यादृच्छिक प्राइमरों के लिए जरूरत नहीं रहेगी और यह संभव कम प्रारंभिक सामग्री का उपयोग करने के लिए संग्रह और नमूने के प्रसंस्करण समय कम है और इस तरह शाही सेना गिरावट कम से कम करना<sup> 4</sup>.<em> इन विट्रो में</em> Amplifying mRNA के लिए प्रतिलेखन तरीकों mRNA polyadenylating शामिल और प्रतिलेख के अंत पर 3 T7 प्रमोटर शामिल है. प्रवर्धित आरएनए (ARNA) तो सीडीएनए फंसे डबल यादृच्छिक hexamers का उपयोग कर परिवर्तित किया जा सकता है और pyrosequencing द्वारा सीधे अनुक्रम<sup> 5</sup>. स्टेशन ALOHA पर इस विधि का पहला प्रयोग माइक्रोबियल समुदाय जीन अभिव्यक्ति निस्र्पक के लिए इसकी उपयोगिता का प्रदर्शन<sup6></sup>.
Protocol
Discussion
प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदायों द्वारा जीन अभिव्यक्ति की जांच सूक्ष्मजीवों के पारिस्थितिक भूमिकाओं और कार्यों का पता लगाने के लिए एक साधन के रूप में हाल के वर्षों में आम बन गया है. पता लगाने, मात्रा क?…
Acknowledgements
अनुदान गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन अनुदान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान MCB 0702125 द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
Referências
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
