Analisi di espressione genica da comunità microbiche marine utilizzando Trascrittomica Ambientale
Summary
Vi presentiamo un metodo per la generazione di cDNA da mRNA ambientale. In generale, l'RNA totale viene prima raccolto dall'ambiente, è selettivamente rimosso rRNA, mRNA è selettivamente amplificato, e cDNA sintetizzato dalla piscina mRNA arricchito è sequenziato. Sequenze recuperato può essere annotati utilizzando le normali tecniche di bioinformatica per identificare i geni espressi.
Abstract
Analogamente al metagenomica, trascrittomica ambientale (metatranscriptomics) recupera e sequenze mRNA ambientali da un assemblaggio microbica senza una preventiva conoscenza di ciò che i geni della comunità potrebbe essere espresso. Così fornisce la prospettiva più imparziale sul espressione comunitaria gene<em> In situ</em>. Ambientale protocolli trascrittomica sono tecnicamente difficili da quando mRNA procariotici generalmente non hanno la poli (A) code che rendono l'isolamento di messaggi eucarioti relativamente semplice<sup> 1</sup> Ea causa del dimezzamento relativamente breve di mRNA<sup> 2</sup>. Inoltre, mRNA sono molto meno abbondanti rispetto rRNA in totale estratti di RNA, quindi un fondo rRNA spesso travolge i segnali mRNA. Tuttavia, le tecniche per superare alcune di queste difficoltà sono stati recentemente sviluppati. Una procedura per l'analisi trascrittomi ambientale con la creazione di librerie di cloni con primer random per invertire-trascrivere e amplificare mRNA ambientale è stato recentemente descritto ha avuto successo in due diversi ambienti naturali, ma i risultati erano influenzate dalla selezione del primer casuali utilizzato per avviare la sintesi di cDNA<sup> 3</sup>. I progressi nella amplificazione lineare dell'mRNA ovviare alla necessità di primer casuali nella fase di amplificazione e permettono di utilizzare meno materiale di partenza diminuire il tempo di elaborazione e raccolta di campioni e minimizzando così la degradazione dell'RNA<sup> 4</sup>.<em> In vitro</emMetodi di trascrizione> per amplificare mRNA coinvolgere polyadenylating l'mRNA e incorporando un promotore T7 sull'estremità 3 della trascrizione. Amplificato RNA (ARNA) possono poi essere convertiti in cDNA doppio filamento usando esameri casuali e direttamente sequenziati da pirosequenziamento<sup> 5</sup>. Un primo utilizzo di questo metodo alla stazione ALOHA dimostrato la sua utilità per la caratterizzazione di comunità microbiche espressione genica<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
L'indagine di espressione genica da parte delle comunità microbiche naturali è diventato comune negli ultimi anni come un mezzo per esplorare il ruolo ecologico e le funzioni dei microrganismi. Usato in combinazione con l'individuazione, quantificazione e caratterizzazione di microrganismi marini, analisi di espressione genica può essere usata per collegare filogenesi di funzionare in comunità microbiche naturali. Molte tecniche per il targeting espressione funzionale del gene contare su sonde specifiche o i…
Acknowledgements
Il finanziamento è stato fornito dalla Gordon and Betty Moore sovvenzioni della Fondazione e la National Science Foundation concedere MCB-0702125.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
Referências
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
