Анализ экспрессии генов из морских микробных сообществ использованием экологических транскриптомику
Summary
Мы представляем способ генерации кДНК из экологических мРНК. В целом, общая РНК впервые собраны из окружающей среды, рРНК выборочно удалить, мРНК селективно усиливается, и кДНК синтезировали из пула мРНК обогащенного последовательности. Восстановленные последовательности могут быть аннотированный биоинформатики с использованием стандартных методов выявления выразил генов.
Abstract
По аналогии с metagenomics, экологические транскриптомику (metatranscriptomics) получает и последовательностей мРНК из экологических микробных сборки без предварительного знания того, что гены сообщество могло бы быть выражение. Таким образом он обеспечивает самый объективный взгляд на сообщество экспрессии генов<em> На месте</em>. Экологические протоколы транскриптомику технически трудно, так как прокариотических мРНК как правило, не поли (А) хвосты, которые делают изоляцию эукариотических сообщения относительно простой<sup> 1</sup> И из-за относительно короткий период полураспада мРНК<sup> 2</sup>. Кроме того, мРНК гораздо менее распространены, чем рРНК в общей сложности экстракты РНК, таким образом, фон рРНК часто подавляет мРНК сигналов. Тем не менее, методы для преодоления некоторых из этих трудностей были недавно разработаны. Процедура анализа экологических transcriptomes путем создания клонов библиотеки с использованием случайных праймеров для обратной транскрипции и усиления экологического мРНК был недавно описан был успешным в двух различных природных средах, но результаты были настроены подбором случайных праймеров используется для инициации синтеза кДНК<sup> 3</sup>. Достижения в области линейного усиления мРНК устранить необходимость для случайных праймеров в усилении шагом и позволяет использовать меньше исходного материала уменьшения сбора и время обработки проб и таким образом минимизируя деградацию РНК<sup> 4</sup>.<em> В пробирке</em> Транскрипции методы для усиления мРНК привлекать polyadenylating мРНК и включения промоутер T7 на 3 конце стенограммы. Усиленный РНК (АРНА) может быть преобразовано в двухцепочечной кДНК с использованием случайных гексамеров и непосредственно путем последовательной пиросеквенирования<sup> 5</sup>. Первое использование этого метода на станции ALOHA продемонстрировала свою полезность для характеристики микробного сообщества экспрессии генов<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
Исследование экспрессии генов с природными микробных сообществ стало обычным в последние годы как средство для изучения экологической роли и функции микроорганизмов. Используется в сочетании с обнаружения, количественное определение и характеристику морских микроорганизмов, анали…
Acknowledgements
Финансирование было предоставлено Гордона и Бетти Мур Фонд грантов и Национального научного фонда грант MCB-0702125.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
Referências
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
