Analysera Gene Expression från Marine mikrobiella samhällen med Miljö transkriptomik

Summary

Vi presenterar en metod för att generera cDNA från miljö-mRNA. I allmänhet är total RNA först samlades från omgivningen, är rRNA selektivt avlägsnas, mRNA är selektivt förstärks, och cDNA syntetiseras från anrikat mRNA poolen är kartlagt. Återvunna sekvenser kan förses med standard bioinformatiska metoder för att identifiera uttryck gener.

Abstract

Analogt med metagenomik, miljö transkriptomik (metatranscriptomics) hämtar och sekvenser miljö mRNA från en mikrobiell samling, utan kunskap om vilka gener samhället kan uttrycka. Således ger den mest objektiva perspektiv på samhället genuttryck<em> På plats</em>. Miljö transkriptomik protokoll är tekniskt svårt eftersom prokaryota mRNA allmänhet saknar poly (A) svans som gör att isolering av eukaryota meddelanden relativt enkel¹ Och på grund av den relativt korta halveringstider av mRNA². Dessutom mRNA är mycket mindre förekommande än rRNAs totalt RNA extrakt, och därmed en rRNA bakgrunden överväldigar ofta mRNA signaler. Dock har tekniker för att övervinna några av dessa svårigheter nyligen utvecklats. Ett förfarande för analys av miljö-transcriptomes genom att skapa klon bibliotek med slumpmässiga primers till omvänd transkribera och förstärka miljö-mRNA har nyligen beskrivit var framgångsrik i två olika naturliga miljöer, men resultaten var partiska genom att välja det slumpmässiga primers som används för att initiera cDNA syntes³. Framsteg inom linjär förstärkning av mRNA undanröja behovet av slumpmässiga primers i amplifieringssteg och göra det möjligt att använda mindre utgångsmaterial minska insamling och bearbetning tid av prover och därmed minimera RNA degradering⁴.<em> In vitro</em> Transkription metoder för förstärkning mRNA innebära polyadenylating mRNA och utrustad med en T7 promotorn på 3 slutet av utskriften. Amplified RNA (ARNA) kan sedan omvandlas till dubbla strandsatta cDNA med hjälp av slumpmässiga hexamerer och direkt sekvenseras med Pyrosequencing⁵. En första användning av denna metod på Station ALOHA visat sitt verktyg för att karakterisera mikrobiell uttryck gemenskap genen⁶.

Protocol

Arbeta med RNA Eftersom RNaser finns överallt och mRNA snabb nedbrytning, standard försiktighetsåtgärder för att arbeta i en ribonukleas-fri miljö måste följas och prover bör behandlas eller bevaras så snart som möjligt efter insamlingen. Del 1: Environmental RNA Collection (för att samla in biomassa i 0,2-3,0 ìm Partikelstorleksfraktioner) Förbrukningsmaterial som behövs: Masterflex slang S…

Discussion

Undersökningen av genuttryck av naturliga mikrobiella samhällen har blivit vanligt på senare år som ett sätt att utforska den ekologiska roller och funktioner av mikroorganismer. Används i kombination med att upptäcka, kvantifiering och karakterisering av marina mikroorganismer kan analyser av genuttryck användas för att länka fylogeni att fungera i naturliga mikrobiella samhällen. Många metoder för inriktning funktionell genuttryck beroende på specifika prober eller ställer primer avsedd för gener känd…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
PowerSoil Bead Tubes	kit	MoBio	12866-25-PBT
RNeasy Mini Kit	kit	QIAGEN	74104
TURBO DNA-free	kit	Ambion	AM1907
mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit	kit	Epicentre	MOP51010/MOP51024
MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit	kit	Ambion	AM1905
MICROBEnrich kit	kit	Ambion	AM1901
MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit	kit	Ambion	AM1790
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	kit	Promega	C4360
Wizard DNA Clean-Up System	kit	Promega	A7280