ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖
Summary
このプロトコルは、分析する方法を示しています<em>ショウジョウバエ</em免疫組織化学および/または神経筋接合部のイメージングのための準備として、>幼虫。
Abstract
市販<em>ショウジョウバエ</em>神経筋接合部（NMJ）は、シナプスの発達と可塑性の研究のために使用される確立されたモデルシステムです。の普及<em>ショウジョウバエ</em>モーターシステムはその高いアクセシビリティによるものです。それは、単一セルの分解能で解析することができます。その配置末梢体壁内に知られているhemisegmentあたり30の筋肉があります。 35運動ニューロンの総数は、高い忠実度を持つパターンにこれらの筋肉に付着する。分子生物学と遺伝学を使用して、一つはトランスジェニック動物または変異体を作成することができます。その後、一つはNMJの形態と機能に関する発達影響を調べることができます。研究のためのNMJにアクセスするためには、それは慎重にそれぞれの幼虫を解剖することが必要である。この記事では、適切に分析する方法を示しています<em>ショウジョウバエ</em体壁には手をつけずにすべての臓器を削除することにより、NMJの研究のための>幼虫。このテクニックは、イメージング、免疫組織化学、または電気生理学のための幼虫を準備するために適しています。
Protocol
あなたが始める前にすべての培養物は25℃で増殖させることが必要 HL3.1解剖バッファは事前に準備されることがあります。 HL3.1の50mlのアリコートを取り、それ氷上で保管してください。 HL3.1で新鮮な3.5％のホルムアルデヒド15mlを準備する。それは氷上に置きます。 幼虫の解剖解剖のプレート上に冷たいHL3.1のドロップを置く。これは簡?…
Discussion
このビデオで示さ解剖手法は、実験技術の様々なショウジョウバエの幼虫を準備するために使用することができます。蛍光タンパク質タグが存在する場合、幼虫をマウントし、すぐにイメージングすることができます。そうでなければ、免疫染色は、特定のシナプスコンパートメントをマークするために行うことができます。さらに、電気生理学は簡単に神経伝達の機能を評価するた?…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss MicroImaging Inc. | 495101-9804-000 | ||
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss | 000000-1063-181 | ||
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools Inc. | 11200-33 | Long forceps | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc. | 11252-20 | Short forceps | |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corp. | 3097358-1004 | Used to make dissection plates | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich Inc. | 252549-25ML | ||
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools Inc. | 26002-10 |
HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
Referências
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, . A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
Citar este artigo
Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107, doi:10.3791/1107 (2009).