Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법
Summary
여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.
Abstract
이 비디오에서는, 우리는 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점 (NMJ)에서 신경 전달 기록에 대한 electrophysiological 방법을 설명합니다. 애벌레 신경근육학 시스템은 시냅스 생리학과 neurotransmission 연구를위한 모델 버렸네이며, 유전학을 정의하고 실험 조작에 액세스할 수있는 가치있는 연구 도구입니다. 애벌레는 몸을 벽 근육, 중추 신경계 및 말초 신경을 노출 해부하실 수 있습니다. Drosophila과 innervation 패턴의 근육이 잘 특징과 근육 세포 기록에 대한 액세스하기 쉽습니다. A7 – 개인 근육은 8 복부 세그먼트, 세그먼트에서 A2를 반복하는 패턴으로 배열된 30 근육과 각 내에 위치와 방향에 의해 확인할 수 있습니다. 해부 drosophila의 애벌레가 얇고 개인 근육과 운동 신경의 axons의 번들하는 것은 transillumination하여 시각 수 있습니다<sup> 1</sup>. 유전자 변형 구조는 시각적인 신원 확인을 위해 또는 특정 조직에 유전자 조작을위한 제품을 대상 세포를 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 애벌레에서 흥분성의 연결 잠재력 (EJPs)은 버렸네에서 motoneurons에서 글루 탐 산염의 기공을 갖는 릴리스에 대응 생성됩니다. 해부 애벌레에서 EJP는 세포내 전극과 근육에 기록하실 수 있습니다. 액션 잠재력은 인위적으로, 복부 신경절에 후부 절단 부드러운 흡입으로 유리 피펫에 그려 및 전극과 자극했습니다 모터 뉴런에 evoked 수 있습니다. 이러한 모터 뉴런은 자극 별개의 소성 한계를 가지고 있고, 그들이 동시에 불을 때, 그들은 근육에 응답을 생성합니다. NMJ 버렸네를 통해 전송되는 신호는 모터 뉴런 신경을 분포시키다 그 근육에 기록하실 수 있습니다. EJPs과 미니어처 흥분성의 접합 잠재력 (mEJPs)가 막 잠재력의 변화로 볼 수 있습니다. Electrophysiological 답변 수정 최소한의 hemolymph 같은 솔루션에서 실온에서 기록됩니다<sup> 2</sup> (HL3) 5 MM의 MG가 포함되어<sup> 2 +</sup> 그리고 1.5 MM 칼슘<sup> 2 +</sup>. evoked EJPs의 진폭의 변화는 시냅스 기능과 구조의 차이를 나타낼 수 있습니다. 디지털 녹음은 EJP 진폭, mEJP 주파수와 진폭, 그리고 quantal 콘텐츠에 대한 분석입니다.
Protocol
Discussion
방법은 NMJ에서 시냅스 기능의 변화를 감지하기 위해 상대적으로 신속하고 광범위한 방법을 제공합니다 여기에서 설명한. 생체내 그대로 동물을 사용하여 electrophysiological 레코딩을 수행하고, 유전이나 약리 조작을 수행할 수있는 능력, Drosophila neurotransmission의 생리 및 유전적 측면을 조사하는 데 이상적인 동물 모델 확인하십시오.
근육 세포가 매우 큰 때문에, 일부는 두…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
Referências
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
