שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית
Summary
כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.
Abstract
בסרטון זה, אנו מתארים את שיטות אלקטרו הקלטה בשידור סינפטי בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחל תסיסנית. מערכת הזחל neuromuscular היא סינפסה מודל לחקר הפיזיולוגיה עצבית הסינפטי ו, ו הוא כלי מחקר חשוב זה הגדיר גנטיקה נגיש מניפולציה ניסויית. הזחלים יכולים להיות גזור כדי לחשוף את הגוף קיר השרירים, מערכת העצבים המרכזית ומערכת העצבים ההיקפית. שרירי תסיסנית דפוס העצבוב שלהם מאופיינים היטב את שרירי קל לגשת להקלטה תאיים. שרירים בודדים ניתן לזהות על ידי מיקומם ואת כיוון בתוך 8 קטעים בטן, כל אחד עם 30 השרירים מסודרים דפוס זה חוזר על עצמו בקטעים A2 – A7. גזור הזחלים תסיסנית הם שרירי רזה הפרט צרורות של אקסונים הנוירון המוטורי ניתן דמיינו ידי שקוף<sup> 1</sup>. בונה טראנסגנטי ניתן להשתמש בתווית תאים היעד לצורך זיהוי חזותי או מניפולציה מוצרים גנים ברקמות ספציפיות. ב זחלים, צומת מעוררים פוטנציאלים (EJPs) נוצרות בתגובה לשחרר שלפוחי של גלוטמט מן motoneurons ב הסינפסה. ב הזחלים גזור, EJP ניתן להקליט בשריר עם אלקטרודה תאיים. פוטנציאל פעולה יכול להיות עורר באופן מלאכותי הנוירונים המנוע, כי כבר לחתוך האחורי אל הגנגליון הגחון, להיגרר פיפטה כוס ידי יניקה עדין מגורה עם אלקטרודה. אלו הנוירונים המנוע יש סף ירי נפרדים כאשר מומרץ, וכשהם אש זמנית, הם מייצרים תגובה בשריר. האותות משודרים ברחבי סינפסה NMJ ניתן להקליט בשרירים כי הנוירונים המנוע innervate. EJPs מיניאטורי הפוטנציאלים צומת מעוררים (mEJPs) נתפסים שינויים פוטנציאל הממברנה. התגובות אלקטרו נרשמות בטמפרטורת החדר בפתרון שונה hemolymph כמו מינימלי<sup> 2</sup> (HL3) המכיל 5 מ"ג mM<sup> 2 +</sup> ו – 1.5 mM Ca<sup> 2 +</sup>. שינויים משרעת של EJPs עורר יכול להצביע על הבדלים בתפקוד המבנה הסינפטי ו. הקלטות סרוקים מנותחים עבור EJP אמפליטודה, תדירות mEJP ואת משרעת ותוכן quantal.
Protocol
Discussion
השיטות שתוארו כאן לספק דרך מהירה יחסית רחבה כדי לזהות שינויים בתפקוד סינפטי ב NMJ. היכולת לבצע הקלטות אלקטרו באמצעות בעלי חיים שלמים in vivo, ולבצע מניפולציות גנטיות או תרופתי, לעשות תסיסנית מודל חיה אידיאלית לחקר היבטים פיזיולוגיים הגנטי של עצבית.
<p class="jove_content" style=";text-…Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
Referências
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
