Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven
Summary
Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.
Abstract
In deze video, beschrijven we de elektrofysiologische methoden voor het opnemen van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie (NMJ) van Drosophila larve. Het larvale neuromusculaire systeem is een model synaps voor de studie van synaptische fysiologie en neurotransmissie, en is een waardevol onderzoeksinstrument dat heeft gedefinieerd genetica en is toegankelijk voor experimentele manipulatie. Larven kunnen worden ontleed om het lichaam muur spieren, het centraal zenuwstelsel en perifere zenuwen bloot te leggen. De spieren van Drosophila en hun innervatie patronen zijn goed gekarakteriseerd en de spieren zijn gemakkelijk te bereiken voor de intracellulaire opname. Individuele spieren kunnen worden geïdentificeerd door hun locatie en oriëntatie binnen de 8 buik-segmenten, elk met 30 spieren gerangschikt in een patroon dat wordt herhaald in segmenten A2 – A7. Ontleed Drosophila larven zijn dun en individuele spieren en bundels van de motor neuron axonen kan worden gevisualiseerd door transilluminatie<sup> 1</sup>. Transgene constructen kunnen worden gebruikt om de doelcellen voor visuele identificatie of voor het manipuleren van genproducten in specifieke weefsels label. In larven, zijn prikkelende knooppunt potentials (EJPs) gegenereerd in reactie op de vesiculaire afgifte van glutamaat uit de motoneuronen in de synaps. In ontleed larven, kan het EJP worden opgenomen in de spier met een intracellulaire elektrode. Actiepotentialen kan kunstmatig worden opgeroepen de motorische neuronen die zijn gesneden posterior aan de ventrale ganglion, getrokken in een glazen pipet met zachte zuigkracht en gestimuleerd met een elektrode. Deze motor neuronen hebben verschillende vuren drempels bij het gestimuleerd, en als ze tegelijkertijd vuur, genereren ze een reactie in de spier. Signalen over de NMJ synaps kunnen worden opgenomen in de spieren die de motor neuronen innerveren. De EJPs en miniatuur prikkelende knooppunt potentials (mEJPs) worden beschouwd als veranderingen in de membraanpotentiaal. Elektrofysiologische reacties worden geboekt bij kamertemperatuur in gewijzigde minimale hemolymfe-achtige oplossing<sup> 2</sup> (HL3) die 5 mM Mg bevat<sup> 2 +</sup> En 1,5 mM Ca<sup> 2 +</sup>. Veranderingen in de amplitude van de opgeroepen EJPs kan duiden op verschillen in de synaptische functie en structuur. Gedigitaliseerde opnames worden geanalyseerd op EJP amplitude, mEJP frequentie en amplitude, en quantale inhoud.
Protocol
Discussion
De hier beschreven methoden zorgen voor een relatief snelle en brede manier om veranderingen in de synaptische functie te detecteren in de NMJ. De mogelijkheid om opnamen met behulp van elektrofysiologische intacte dieren uit te voeren in vivo, en het uitvoeren van genetische of farmacologische manipulatie, maken Drosophila een ideale diermodel voor onderzoek naar de fysiologische en genetische aspecten van neurotransmissie.
Omdat spiercellen zijn zeer groot, kunnen de voorkeur aan een extra…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
Referências
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
