Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico
Summary
Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.
Abstract
Gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l'individuo e la società, che costano oltre 100 miliardi di dollari all'anno. Nonostante l'uso diffuso di monitoraggio della glicemia e insulina formulazioni nuove, molte persone ancora sviluppare devastanti complicanze secondarie. Trapianto di isole pancreatiche in grado di ripristinare nei pressi di controllo normale del glucosio in pazienti diabetici<sup> 1</sup>, Senza il rischio di gravi episodi di ipoglicemia che sono associati con la terapia insulinica intensiva. Fornire sufficiente massa isolotto è importante per il trapianto di isole pancreatiche di successo. Tuttavia, caratteristica dei donatori, reperimento di organi e la conservazione influenzare l'esito isolamento<sup> 2</sup>. Presso l'Università dell'Illinois a Chicago (UIC), abbiamo sviluppato un protocollo di successo isolamento con pendenza purificazione migliorato<sup> 3</sup>. Il programma è iniziato nel gennaio 2004, e più di 300 isolamenti sono stati effettuati fino a novembre 2008. Il pancreas sono stati inviati nelle soluzioni di conservazione a freddo (UW, University of Wisconsin o HTK, Istidina, Triptofano chetoglutarato)<sup> 4-7</sup> Al Laboratorio cella d'isolamento a UIC per l'isolamento delle isole. Isole pancreatiche sono stati isolati con il metodo UIC, che è una versione modificata del metodo originariamente descritto da Ricordi<em> Et al</em><sup> 8</sup>. In breve, dopo aver pulito il pancreas dal tessuto circostante, è stato perfuso con soluzione enzimatica (Serva Collagenasi + Neutro Sigma enzima proteasi o V). Il pancreas è stato dilatato poi trasferito nella camera di digestione Ricordi, collegato ad una modifica, sistema chiuso tubi circolazione, e riscaldato a 37 ° C. Durante la digestione, la camera era scosso dolcemente. I campioni sono stati presi costantemente per monitorare il processo di digestione. Una volta libero isolette sono state rilevate al microscopio, la digestione è stato fermato da lavaggio a freddo (4 ° C) RPMI soluzione di diluizione (Mediatech, Herndon, VA) nel sistema di circolazione per diluire l'enzima. Dopo essere raccolte e lavate in M199 mezzi di comunicazione integrato con albumina umana, il tessuto è stato campionato per la pre-purificazione contare e incubati con soluzione UW prima purificazione. Processo di purificazione saranno descritti nella Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane.
Protocol
Discussion
Ci sono una varietà di fattori che influenzano il risultato dell'isolamento 9,10. Tra questi, la digestione del tessuto pancreatico gioca un ruolo di primo piano. Sulla base della nostra esperienza umana isolamento delle isole, abbiamo riassunto i seguenti punti critici, che potrebbe potenzialmente influenzare il rendimento delle isole e la qualità.
- Il tempo di digestione è diversa quando i diversi tipi di enzimi sono utilizzati.
- Non appena il 40-50% delle isole completamente separate dal t…
Acknowledgements
Supportato da un finanziamento della University of Illinois a Chicago, nonché delle cellule delle isole Resource Center NIH di sovvenzione (RFA-RR 05-003), la Fondazione Cristoforo, la Fondazione Efroymson, e la Fondazione Tellabs.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Metler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole Parmer Instrument Co | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made/Swiss | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech Inc | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
Referências
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
