Tillverkning av Myogenic vävnadstekniska Konstruerar
Summary
Här visar vi tillverkning av kollagen-baserade konstruktioner vävnad innehåller skelett myoblasts. Dessa 3-D-tillverkade konstruktioner kan användas för att ersätta eller reparera vävnader<em> In vivo</em>. För våra syften har vi utformat dessa som en atrioventrikulärt elektriska isolerrör för reparation av kompletta hjärtblock<sup> [1]</sup>.
Abstract
Trots att elektroniska pacemaker är livräddande medicinsk utrustning, kan deras långsiktiga resultat hos barn vara problematisk på grund av de begränsningar som ett barns lilla storlek och deras oundvikliga tillväxt. Följaktligen finns det ett verkligt behov av innovativa terapier som utformats speciellt för barn med hjärtrytm störningar. Vi föreslår att en ledande biologiskt alternativ som består av en kollagenbaserade matris som innehåller autologously som härrör cellerna bättre kan anpassa sig till tillväxten, minska behovet av återkommande operationer, och avsevärt förbättra livskvaliteten för dessa patienter. I den aktuella studien beskriver vi en metod för att införliva primär skelett kulturer myoblast cell inom en hydrogel matris till mode ett kirurgiskt implanterbara vävnad konstruktion som kommer att fungera som en elektrisk ledning mellan övre och undre kammare i hjärtat. I slutändan räknar vi använda denna typ av vävnadstekniska att återställa atrioventrikulär elektrisk ledningsförmåga hos barn med komplett hjärtblock. Med tanke på att isolera vi myoblasts från skelettmuskulaturen av neonatal Lewis råttor och platta ut dem på laminin-belagd vävnadsodling rätter med hjälp av en modifierad version av fastställda protokoll<sup> [2, 3]</sup>. Efter en till två dagar, odlade celler samlas och blandas med antibiotika, typ 1 kollagen, Matrigel ™ och NaHCO<sub> 3</sub>. Resultatet är en trögflytande, enhetlig lösning som kan gjutas i en form av nästan alla former och storlekar<sup> [1, 4, 5]</sup>. För våra vävnad konstruktioner, sysselsätter vi typ 1 kollagen isolerade från foster lamm huden med hjälp av standardprocedurer<sup> [6]</sup>. När vävnad har stelnat vid 37 ° C, odlingssubstrat försiktigt läggas på plattan tills konstruktion är under vatten. Den vävnadstekniska får sedan ytterligare kondensera genom uttorkning i 2 dagar, då den är klar för<em> In vitro</em> Bedömning eller kirurgisk implantation.
Protocol
Discussion
De formar i vilka vävnaden bygga kommer att kastas kan göras i någon form och storlek, men det måste finnas minst två fästpunkter. Annars matrisen och cellerna bildar en sfärisk struktur och cellerna dör. I det nuvarande protokollet beskriver vi användandet av en polyester mesh för detta ändamål, men vi har även framgångsrikt använt rostfritt stål. Självklart kommer större formar kräver mer celler och en större volym av de andra ingredienserna. Vid formarna är det viktigt att minimera mängden av si…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av forskningsanslag från National Institutes of Health (HL068915, HL088206), en ny forskare Award från Thrasher Research Fund, och bidrag till hjärtöverledning fonden vid barnsjukhuset Boston.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Silicone tubing | VWR | 60985-724 | ||
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | ||
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | ||
| Laminin | Sigma | L2020 | ||
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma | N6908 | ||
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | ||
| Dispase-2 | Roche | 10295825001 | ||
| Collagenase 2 | Worthington | 46H8863 | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G5071 | ||
| 150 mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353025 | ||
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | ||
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | ||
| 7.5% NaHCO3 | Gibco | 25080-094 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| 50 mL Conical Vial | BD Falcon | 352098 | ||
| 15 mL Conical Vial | BD Falcon | 352099 | ||
| 0.2 μm filter | Nalgene | 194-2520 |
Referências
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
