Измерение Ближнего плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в астроциты
Summary
Мы опишем, как измерить возле мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в культуре астроцитов использованием полного внутреннего отражения и epifluorescence микроскопии.
Abstract
Мозг содержит глиальные клетки. Астроциты, типа глиальных клеток, уже давно известно, обеспечивают пассивную вспомогательную роль для нейронов. Тем не менее, все больше данных о том, что астроциты также могут активно участвовать в функции мозга с помощью функциональной взаимодействия с нейронами. Однако, многие фундаментальные аспекты астроцитов биологии остаются спорными, неясными и / или экспериментально неизученными. Одним из важных вопросов является динамика внутриклеточного кальция в переходных астроцитов. Это важно, поскольку кальций хорошо известна как важный вторичный мессенджер и потому, что было предложено, что астроциты высотах кальция может вызвать выпуск передатчиков из астроцитов. Тем не менее, не было никакой детальной или удовлетворения описание около кальция плазматической мембраны сигнализации в астроциты. Полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия является мощным инструментом для анализа физиологически соответствующих сигнальных событий в течение приблизительно 100 нм плазматической мембраны живых клеток. Здесь мы используем TIRF микроскопии и описывают, как монитор вблизи плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция почти одновременно. Дальнейшее уточнение и систематическое применение этого подхода есть потенциал, чтобы сообщить о точных деталях астроцитов сигнализации кальция. Детальное понимание астроцитов динамики кальция могут служить основой для понимания, если, как, когда и почему астроцитов и нейронов проходят кальций-зависимых функциональных взаимодействий.
Protocol
Discussion
Хорошо установлено, что астроциты дисплей внутриклеточного кальция высот. Это происходит спонтанно, может быть вызвана активность нейронов или с применением агонистов для активации рецепторов на поверхности астроцитов 11. Одним из важных и спорный вопрос, является ли астроцитов внутриклет…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Уэхара Мемориальный фонд Японии (Е. С.), а также Уайтхолл Фонд Национального института неврологических расстройств и инсульта и Штайн-Оппенгеймера фонда премии (для БСК).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargille | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | WARNER Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | WARNER Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
Referências
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
