Живая съемка Плотные-ядерные Пузырьки в начальной культивированный нейронов гиппокампа
Summary
Живая клетка изображений имеет особую полезность при изучении динамики торговли органелл. Здесь мы опишем протокол для живого изображения плотных процессоров пузырьки в культуре нейронов использованием широкого поля флуоресцентной микроскопии. Этот протокол является гибкой и может быть адаптирована для изображения других органелл типа митохондрий, эндосомы и пероксисом.
Abstract
Наблюдение и характеризующих динамическую клеточных процессов может дать важную информацию о клеточной активности, которые не могут быть получены из статических изображений. Vital флуоресцентных зондов, особенно зеленый флуоресцентный белок (GFP) произвели революцию клеточной биологии, вытекающих из способности этикетке конкретного внутриклеточные отсеки и клеточных структур. Например, жить изображений GFP (и его спектральный варианты) химерами позволили динамического анализа цитоскелета, органелл транспорта и мембраны динамика во множестве организмов и типов клеток [1-3]. Хотя жить изображений стала распространенной, этот подход до сих пор вызывает много технических проблем, особенно в начальной культурный нейронов. Одной из проблем является выражением GFP с метками белков в пост-митотического нейроны, а другая возможность захвата флуоресцентные изображения при минимальном фототоксичности, фотообесцвечивания, а также поддержание общего здоровья клеток. Здесь мы предлагаем протокол, который описывает на основе липидов трансфекции метод, который дает относительно низкий уровень трансфекции (~ 0,5%), однако идеально подходит для визуализации полностью поляризованных нейронов. Низкий уровень трансфекции важно, чтобы один аксонов и дендритов может быть охарактеризована как их ориентации в тело клетки, чтобы подтвердить направленность транспорта, т.е., антероградная против ретроградной. Наш подход к визуализации GFP выражения нейронов зависит от стандартного широкого поля флуоресцентный микроскоп оснащен ПЗС-камеры, программное обеспечение захвата изображения, а также подогревом камеры изображений. Мы отображаемого разнообразных органелл или сооружений, например, плотной основной пузырьков, митохондрий, конусы роста, и актин без каких-либо специальной оптики или возбуждения условий, отличных от флуоресцентных источников света. Кроме того, спектрально-различны, флуоресцентно меченых белков, например, GFP и DsRed с метками белки, могут быть визуализированы возле одновременно для характеристики со-транспортных и иных скоординированных клеточных событий. Изображения Описанный здесь подход является гибким для различных приложений и изображения могут быть приняты лаборатории при относительно небольших затратах при условии, микроскоп доступен.
Protocol
Discussion
Живая визуализации ячейки сложным, но мощная техника для прямого наблюдения органелл транспорта в культуре нейронов. Трудности могут возникнуть перед процедурой с плохим нейрона здоровья из-за культуры осложнений. Таким образом, клетка здоровье (примеры см. ссылка 4) должны быть оцене?…
Acknowledgements
Мы благодарим Харальд Хуттер и Елена Decker для их внимательного прочтения этой рукописи. Мы также благодарим Reg Сидху из Leica Microsystems для своих технических знаний. Это исследование было поддержано Национальным наук и инженерного совета Канады, премия # 327100-06, и Simon Fraser University Факультет естественных наук.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
Referências
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
