يعيش تصوير الكثيفة الأساسية الحويصلات في الخلايا العصبية الأولية الحصين مثقف
Summary
التصوير الخلية الحية ذات فائدة خاصة عند دراسة ديناميات الاتجار عضية. نحن هنا وصف بروتوكول لحية كثيفة التصوير الأساسية الحويصلات في الخلايا العصبية مثقف واسع باستخدام الحقل المجهري مضان. هذا البروتوكول هو مرن ، ويمكن أن تتكيف مع العضيات صورة أخرى مثل الميتوكوندريا ، الإندوسومات وperoxisomes.
Abstract
ويمكن رصد وتوصيف العمليات الحيوية الخلوية تعطي معلومات مهمة عن نشاط الخلوية التي لا يمكن اكتسابها من الصور الثابتة. تحقيقات الفلورسنت الحيوية ، وخاصة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أحدثت ثورة في بيولوجيا الخلايا النابعة من القدرة على تسمية محددة المقصورات داخل الخلايا والهياكل الخلوية. على سبيل المثال ، فقد سمح للتصوير حي لالوهم (ومشتقاته الطيفية) GFP لتحليل ديناميكية الهيكل الخلوي والنقل عضية ، والديناميات الغشاء في العديد من الكائنات الحية وأنواع الخلايا [1-3]. على الرغم من أن التصوير العيش أصبحت سائدة ، وهذا النهج لا يزال يشكل تحديات تقنية كثيرة ، ولا سيما في الخلايا العصبية مثقف الابتدائي. التحدي الأول هو التعبير عن GFP الموسومة البروتينات في الخلايا العصبية بعد الإنقسامية ، والآخر هو القدرة على التقاط الصور مع تقليل الفلورسنت الضيائية ، photobleaching ، والمحافظة على الصحة العامة الخلية. هنا نقدم البروتوكول الذي يصف طريقة ترنسفكأيشن الدهون على أساس أن معدل الغلة ترنسفكأيشن منخفضة نسبيا (~ 0.5 ٪) ، ولكن مثالية لتصوير الخلايا العصبية مستقطبة تماما. انخفاض معدل ترنسفكأيشن ضروري بحيث يمكن وصفها احد المحاور والتشعبات ولميولهم الى خلايا الجسم لتأكيد اتجاهها النقل ، أي تقدمي ضد الرجعية. نهجنا في GFP التصوير معربا عن الخلايا العصبية تعتمد على مجال واسع المجهر الفلورسنت القياسية مزودة كاميرا CCD ، برامج التقاط الصور ، وغرفة التصوير ساخنة. وقد التقط لدينا تشكيلة واسعة من العضيات أو هياكل ، على سبيل المثال ، كثيفة الأساسية الحويصلات ، الميتوكوندريا مخاريط النمو ، ودون أي أكتين البصريات خاصة أو متطلبات أخرى الإثارة من مصدر ضوء الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن طيفيا ، متميزة ، والبروتينات fluorescently المسمى ، على سبيل المثال ، والبروتينات GFP dsRed الموسومة ، يمكن تصور القريب في وقت واحد لتحديد خصائص النقل المشترك أو غيرها من الأحداث الخلوية منسقة. النهج التصوير الموصوفة هنا هي مرنة لمجموعة متنوعة من تطبيقات التصوير ويمكن اعتمادها من قبل مختبر لتوفير التكلفة ستكون قليلة نسبيا المجهر هو متاح.
Protocol
Discussion
يعيش التصوير الخلية هي تقنية صعبة ، ولكنها قوية لمراقبة وسائل النقل المباشر عضية في الخلايا العصبية مثقف. يمكن أن تنشأ صعوبات من المنبع الإجراء مع صحة الخلايا العصبية الفقراء بسبب مضاعفات الثقافة. ولذلك ، ينبغي تقييم صحة الخلية (انظر المرجع للحصول على أمثلة 4) قبل وبع…
Acknowledgements
نشكر هارالد هوتر وديكر هيلانة لقراءتهم متأنية لهذه المخطوطة. ونحن نشكر أيضا ريج سيدو من ايكا مايكروسيستمز لخبرته الفنية. وأيد هذا البحث من قبل العلوم والهندسة مجلس الوطني لكندا ، وجائزة # 327100-06 ، وكلية جامعة سايمون فريزر للعلوم.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
Referências
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
