在原代培养海马神经元的密集核心囊泡的实时成像
Summary
活细胞成像研究细胞器官贩卖的动态时，特别实用。在这里，我们描述了一个致密核心囊泡在培养的神经元，采用宽视场荧光显微镜的实时成像的协议。此协议是灵活的和可适应图像的其它细胞器如线粒体，内体，和过氧化物酶。
Abstract
动态细胞过程的观测和特征，可以产生对细胞活性，不能从静态图像获得的重要信息。重要的荧光探针，尤其是绿色荧光蛋白（GFP）已经彻底改变了细胞生物学能力标签特定的细胞内的车厢和细胞结构产生。例如，允许实时成像的GFP（和其光谱变种）嵌合体的细胞骨架，细胞器运输，并在众多生物和细胞类型[1-3]膜动态动态分析。虽然实时成像已成为普遍的，这种做法仍然引起了许多技术挑战，特别是在原代培养的神经元，。挑战之一是GFP标记的蛋白质在有丝分裂后神经元的表达，另一种是能够捕捉到的荧光图像，同时最大限度地减少光毒性，漂白，并保持细胞的健康一般。在这里，我们提供了一个协议，它描述了一个脂质体转染法，收益率相对较低的转染率（0.5％），但是是完全极化神经元成像的理想选择。低转染率是至关重要的，使单个轴突和树突细胞体内的方向的特点，以确认的方向性，即运输，顺行诉逆行。我们的方法来成像GFP的表达神经元依赖于一个标准的宽视场荧光显微镜与CCD摄像头，图像采集软件，和热成像室配备。我们有成像的细胞器或结构的种类繁多，例如，没有任何特殊的光学或激发需求，比荧光灯光源的致密核心囊泡，线粒体，生长锥，与肌动蛋白。此外，不同的光谱，荧光标记的蛋白质，例如，绿色荧光蛋白和蛋白DsRed的标签，可附近同时可视化表征的合作运输或其他协调的细胞活动。成像方法，这里描述的是各种成像应用灵活，可以由实验室通过相对较少的成本提供了一个显微镜。
Protocol
Discussion
活细胞成像是一个具有挑战性，但强大的技术，直接观察培养的神经元细胞器运输。困难可能会出现上游与神经元的健康欠佳，由于文化并发症程序。因此，细胞的健康（例子见文献4）应评估转染前后，而在生长介质中使用组织培养，光镜下观察盖玻片。转移过程中的神经元含有盖玻片成像室，可紧张的细胞，因此重要的是要小心操纵的盖玻片。它可以是共同的，健康的细胞没有运输过程中的延…
Acknowledgements
我们感谢他们仔细阅读这篇稿子哈拉尔胡特尔和海伦娜德克尔。我们也感谢徕卡Microsystems的注册Sidhu，他的技术专长。这项研究是由美国国家科学与工程理事会，加拿大，奖＃327100-06，西蒙弗雷泽大学理学院的支持。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
Referências
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
