Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen
Summary
Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.
Abstract
Observeren en karakteriseren van dynamische cellulaire processen kan belangrijke informatie opleveren over cellulaire activiteit die niet kan worden verkregen uit statische afbeeldingen. Vital fluorescerende probes, in het bijzonder groen fluorescerend eiwit (GFP) hebben een revolutie teweeggebracht in de celbiologie die voortvloeien uit de mogelijkheid om specifieke intracellulaire compartimenten en cellulaire structuren label. Zo hebben de live beeldvorming van GFP (en de spectrale varianten) hersenspinsels toegestaan voor een dynamische analyse van het cytoskelet, organellen transport, en membraan dynamiek in een veelheid van organismen en celtypes [1-3]. Hoewel de live-imaging is geworden gangbaar, deze aanpak brengt nog veel technische uitdagingen, met name in de eerste gekweekte neuronen. Een uitdaging is de uitdrukking van GFP-gemerkte eiwitten in de post-mitotische neuronen, de andere is de mogelijkheid om fluorescerende beelden vast te leggen terwijl het minimaliseren van fototoxiciteit, fotobleken, en onderhouden van de algemene gezondheid van de cellen. Hier hebben we een protocol dat een lipide-gebaseerde transfectie methode die een relatief lage transfectie tarief (~ 0,5%) geeft een beschrijving, maar is ideaal voor de beeldvorming van volledig gepolariseerd neuronen. Een lage transfectie zijn essentieel, zodat een axonen en dendrieten kan worden gekenmerkt als hun oriëntatie op de cel lichaam gerichtheid van het vervoer, dat wil zeggen, anterograde v. retrograde te bevestigen. Onze benadering van beeldvorming GFP uiten van neuronen is gebaseerd op een standaard wide-field fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera, beeld software voor het vastleggen, en een verwarmd imaging kamer. We hebben belicht een breed scala van organellen of structuren, bijvoorbeeld, dichte-core vesicles, mitochondria, de groei kegels, en actine zonder speciale lenzen of excitatie andere eisen dan een TL-lichtbron. Bovendien kunnen spectraal-onderscheiden, fluorescent gelabelde eiwitten, bijvoorbeeld GFP en DsRed-gemerkte eiwitten, gevisualiseerd in de buurt gelijktijdig mee te vervoeren of andere gecoördineerde cellulaire gebeurtenissen karakteriseren. De imaging benadering hier beschreven is flexibel voor een verscheidenheid aan grafische toepassingen en kan worden vastgesteld door een laboratorium voor relatief weinig kosten mits een microscoop beschikbaar is.
Protocol
Discussion
Live-cell imaging is een uitdagende, maar krachtige techniek voor de directe waarneming van organel transport in gekweekte neuronen. Problemen kunnen ontstaan stroomopwaarts van de procedure met een slechte gezondheid neuron te wijten aan de cultuur complicaties. Daarom moeten cel gezondheid (voor voorbeelden zie ref. 4) worden beoordeeld voor en na transfectie door het observeren van de dekglaasjes terwijl in groeimedium met behulp van een weefselkweek lichtmicroscoop. Het proces van de overdracht van neuron-beva…
Acknowledgements
Wij danken Harald Hutter en Helena Decker voor hun zorgvuldige lezing van dit manuscript. We danken ook Reg Sidhu van Leica Microsystems voor zijn technische expertise. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Sciences and Engineering Council of Canada, Award # 327100-06, en de Simon Fraser University faculteit Bètawetenschappen.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
Referências
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
