Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen
Summary
Live Cell Imaging ist von besonderem Nutzen bei der Untersuchung der Dynamik von Organellen Menschenhandel. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Darstellung von Dense-Core-Vesikel in kultivierten Neuronen mit Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll ist flexibel und kann an image anderen Organellen wie Mitochondrien angepasst werden, Endosomen und Peroxisomen.
Abstract
Beobachtung und Charakterisierung dynamischer zellulärer Prozesse liefern wichtige Informationen über die Zellaktivität, die nicht aus statischen Bildern gewonnen werden kann. Vital fluoreszierenden Sonden, besonders grün fluoreszierende Protein (GFP) revolutioniert haben Zellbiologie, die aus der Fähigkeit, spezifische intrazelluläre Kompartimente und zelluläre Strukturen Etikett. Zum Beispiel haben die Live-Darstellung von GFP (und seine spektralen Varianten) Chimären für eine dynamische Analyse des Zytoskeletts, Organellentransports und Membran Dynamik in einer Vielzahl von Organismen und Zelltypen [1-3] erlaubt. Obwohl Live-Bildgebung hat sich verbreitet, dieser Ansatz wirft immer noch viele technische Herausforderungen, vor allem in primären kultivierten Neuronen. Eine Herausforderung ist die Expression von GFP-markierten Proteine in post-mitotischen Neuronen, die andere ist die Fähigkeit, fluoreszierende Bilder zu erfassen bei gleichzeitiger Minimierung der Phototoxizität, Ausbleichen und Wartung allgemein Zelle Gesundheit. Hier bieten wir ein Protokoll, das eine Lipid-basierte Transfektion Methode, die einen relativ niedrigen Transfektionsrate (~ 0,5%) ergibt beschreibt, ist aber ideal für die Abbildung vollständig polarisierte Neuronen. Eine geringe Transfektionseffizienz ist unerlässlich, so dass einzelne Axone und Dendriten im Hinblick auf ihre Orientierung an den Zellkörper charakterisiert werden kann, um die Ausrichtung des Verkehrs, dh anterograde v. retrograde bestätigen. Unser Ansatz zur Bildgebung GFP-exprimierenden Neuronen beruht auf einem Standard-wide-field Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera, Bild-Capture-Software, und ein beheiztes Bildgebung Kammer ausgestattet. Wir haben eine Vielzahl von Organellen oder Strukturen abgebildet werden, zum Beispiel, dense-core Vesikel, Mitochondrien, Wachstum Kegel, und Aktin ohne besondere Optik oder Anregung andere Anforderungen als einer fluoreszierenden Lichtquelle. Darüber hinaus können spektral unterschiedlichen, fluoreszenzmarkierten Proteine, zB GFP und DsRed-markierte Proteine werden in der Nähe gleichzeitig visualisiert werden, um Co-Transport-oder andere koordinierte zelluläre Ereignisse zu charakterisieren. Die Bildgebung hier beschriebene Ansatz ist flexibel für eine Vielzahl von Imaging-Anwendungen und kann durch ein Labor für die relativ geringen Kosten angenommen werden, falls ein Mikroskop zur Verfügung.
Protocol
Discussion
Live Cell Imaging ist eine Herausforderung, aber wirkungsvolle Technik für die direkte Beobachtung von Organellentransports in kultivierten Neuronen. Schwierigkeiten können vor-kommen des Verfahrens mit einer schlechten Neuron Gesundheit, die auf Kultur Komplikationen. Daher sollten Zelle Gesundheit (Beispiele siehe ref. 4) vor und nach der Transfektion durch die Beobachtung der Deckgläser, während in Wachstumsmedium mit einer Gewebekultur Lichtmikroskop beurteilt werden. Der Prozess der Übertragung von Neuron-halt…
Acknowledgements
Wir danken Harald Hutter und Helena Decker für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts. Wir danken auch Reg Sidhu von Leica Microsystems für seine technische Kompetenz. Diese Arbeit wurde von der National Sciences and Engineering Council of Canada, Award # 327100-06, und der Simon Fraser University Faculty of Science unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
Referências
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
