Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas
Summary
Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.
Abstract
La observación y la caracterización dinámica de los procesos celulares pueden dar información importante sobre la actividad celular que no se puede obtener a partir de imágenes estáticas. Vital sondas fluorescentes, especialmente proteína fluorescente verde (GFP) ha revolucionado la biología celular derivada de la capacidad de etiqueta específica compartimentos intracelulares y las estructuras celulares. Por ejemplo, la imagen en vivo de las buenas prácticas agrarias (y sus variantes espectral) quimeras han permitido un análisis dinámico del citoesqueleto, orgánulos de transporte, y la dinámica de la membrana en una multitud de organismos y tipos de células [1-3]. A pesar de imagen en vivo se ha convertido en frecuente, este enfoque también plantea muchos problemas técnicos, sobre todo en primaria neuronas cultivadas. Uno de ellos es la expresión de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en las neuronas post-mitóticas, y el otro es la capacidad de capturar imágenes fluorescentes y reducir al mínimo la fototoxicidad, photobleaching, y mantener la salud celular en general. Aquí les ofrecemos un protocolo que describe un método de transfección basado en lípidos que produce una tasa de transfección relativamente baja (~ 0,5%), sin embargo, es ideal para la proyección de imagen de las neuronas totalmente polarizada. Una baja tasa de transfección es esencial para que los axones y las dendritas solo puede ser caracterizado en cuanto a su orientación hacia el cuerpo celular para confirmar la direccionalidad del transporte, es decir, anterógrada v. retrógrada. Nuestro enfoque de la imagen de las neuronas que expresan GFP se basa en un estándar de campo amplio microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD, software de captura de imágenes, y una cámara de imágenes calientes. Hemos fotografiado una amplia variedad de organelos o estructuras, por ejemplo, denso núcleo de las vesículas, los conos de la mitocondria, el crecimiento y la actina sin ningún tipo de óptica o requisitos especiales de excitación que no sea una fuente de luz fluorescente. Además, espectralmente diferentes, las proteínas de la etiqueta fluorescente, por ejemplo, las buenas prácticas agrarias y de las proteínas dsRed con etiquetas, se puede visualizar al mismo tiempo cerca de caracterizar el transporte co-u otros eventos celulares coordinada. El enfoque de imagen se describe aquí es flexible para una variedad de aplicaciones de imagen y pueden ser adoptadas por un laboratorio de un costo relativamente bajo un microscopio siempre está disponible.
Protocol
Discussion
Imágenes de células vivas es una técnica difícil, pero de gran alcance para la observación directa de transporte de orgánulos en las neuronas cultivadas. Pueden surgir dificultades aguas arriba del procedimiento con la salud neuronal pobres debido a las complicaciones cultura. Por lo tanto, la salud celular (para ejemplos, ver ref. 4) deben ser evaluados antes y después de la transfección mediante la observación de los cubreobjetos, mientras que en medio de crecimiento con un cultivo de tejidos microscopio de l…
Acknowledgements
Damos las gracias a Harald Hutter y Decker Helena por su cuidadosa lectura de este manuscrito. También agradecemos a Reg Sidhu de Leica Microsystems por su experiencia técnica. Esta investigación fue apoyada por el Nacional de Ciencias e Ingeniería del Consejo de Canadá, el Premio # 327100-06, y de la Simon Fraser Facultad Universitaria de Ciencias.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
Referências
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
