Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.
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Artigo de método
Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros
Neste artigo
Resumo
Resumo
Complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II tetrâmeros permite a visualização direta do antígeno específico CD4 + células T por citometria de fluxo. Esse método se baseia na interação altamente específica entre peptídeo carregado MHC eo receptor de células T correspondente. Enquanto a afinidade de uma molécula MHC / peptídeo única é baixa, cross-linking complexos MHC / peptídeo com estreptavidina aumenta a avidez da interação, possibilitando a sua utilização como coloração reagentes. Por causa das freqüências relativamente baixas de células CD4 + T (~ 1 em 300.000 para uma especificidade única) este ensaio utiliza um passo de amplificação in vitro para aumentar o seu limiar de detecção. Células mononucleares são purificadas do sangue periférico por underlay Ficoll. CD4 + células são então separados por seleção negativa usando cocktail anticorpo biotinilado e anti-biotina marcada esferas magnéticas. Usando células aderentes a partir da fração de células CD4-células apresentadoras de antígenos como, células T CD4 + são expandidos em mídia pela adição de um peptídeo antigênico e IL-2. As células expandidas estão manchadas com o correspondente da classe II tetrâmero pela incubação a 37 C por uma hora e, posteriormente, coradas anticorpos de superfície, como anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Após a marcação, as células podem ser diretamente analisados por citometria de fluxo. As células positivas tetrâmero normalmente formam uma população distinta entre os CD4 + células expandidas. Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados. Porque o nível de coloração tetrâmero fundo pode variar, os resultados da coloração positiva deve ser sempre comparado com a coloração das células mesmo com um tetrâmero irrelevante. Múltiplas variações deste ensaio básicas são possíveis. Tetrâmero células positivas podem ser classificadas para a análise fenotípica ainda, a inclusão no ELISPOT ou ensaios de proliferação, ou outros ensaios secundários. Vários grupos também demonstraram co-coloração usando tetrâmeros e ou de citocinas anti-ou anti-FoxP3 anticorpos.
Protocolo
1. Do sangue periférico mononuclear cela de isolamento (PBMC)
- Obter uma amostra de sangue - sangue deve ser coletado em seringas ou tubos de sangue e anti-coagulado com heparina (1:50 ratio) para prevenir a coagulação. Esperar um rendimento de cerca de 1 × 10 6 PBMC por mL de sangue - cerca de 40% dos quais serão CD4 positivos (CD4 +) células T.
- Alíquota do sangue em tubos cônicos de 50 mL, 25 mL por tubo. Se o sangue tem separado, misture suavemente antes de alíquotas para distribuir o plasma
- Adicionar PBS, elevando o volume total de 40 mL e underlay através da elaboração de 11 mL de Ficoll, inserindo no tubo de sangue, e co....
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Discussão
Compreensão do papel das células T CD4 + na imunidade é de fundamental importância. No entanto, CD4 + antígeno específico das células T pode ser difícil de detectar e isolar usando métodos tradicionais. Em contraste, tetrâmeros de MHC classe II permite a visualização direta de células CD4 + T com a especificidade do antígeno desejado. Este vídeo demonstra o isolamento, purificação e amplificação in vitro de células CD4 + T e sua visualização posterior usando tetrâmeros. Tetrâmeros de classe II são conjugados proteína fl.......
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Agradecimentos
Agradecemos a Dick Foley e Leigh Kimball para seus papéis-chave na filmagem e produção de vídeo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Capela de fluxo laminar Classe 2 | equipamento | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Ou equivalente |
| Tubo cônico de 50 mL | equipamento | VWR international | 47747-182 | Ou equivalente |
| PBS 1X (sem Ca/Mg) | Reagente | Hyclone | SH30028.02 | Ou equivalente |
| Ficoll-paque PLUS | Reagente | GE Healthcare | 17-1440-03 | envolvido em papel alumínio para proteger da luz |
| Pipetador Pipet Aid XP | equipamento | Drummond Scientific | 4-000-101 | Ou equivalente |
| Pipeta de 10 mL | equipamento | Corning | CLS4492 | Ou equivalente |
| Cartuchos Aerosolve | equipamento | Beckman Coulter Inc. | 359481 | com inserções de 50 mL |
| Centrífuga | equipamento | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Ou equivalente |
| Pipetas de transferência | equipamento | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Ou equivalente |
| Pipetas Pasteur | equipamento | VWR international | 14672-200 | Ou equivalente |
| Tampão hemolítico | Reagente | N/A | N/A | 8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L EDTA dissódico |
| Azul de tripano | Reagente | Sigma-Aldrich | T6146 | 0,2% em PBS |
| Hemocitômetro | equipamento | VWR international | 15170-208 | |
| Tubo cônico de 15 mL | equipamento | VWR international | 05-527-90 | Ou equivalente |
| Tampão de corrida | Reagente | N/A | N/A | PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA |
| Kit de Isolamento de Células T CD4+ MACS II | Reagente | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Ou equivalente |
| Ímã EasySep® | equipamento | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Tubo de polipropileno de 5 mL | equipamento | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagente | Invitrogen | 22400-089 | com 25 mM HEPES |
| Soro humano em pool | Reagente | N/A | N/A | coletado de doadores saudáveis, inativado pelo calor e filtrado |
| Pen Strep | Reagente | Invitrogen | 1570-063 | Ou equivalente |
| Filtro de garrafa de 500 mL com poro de 0,22 mícron | equipamento | Nalge Nunc international | 595-3320 | Ou equivalente |
| Placa de 48 poços | equipamento | Costar | 3548 | Ou equivalente |
| Incubadora a 37°C com CO2 | equipamento | Sanyo | MCO-18AIC | Ou equivalente |
| Peptídeo sintético de 20 mg/mL | Reagente | N/A | N/A | Síntese personalizada com qualquer fornecedor de peptídeos |
| Tubo FACS de 5 mL | equipamento | Falcon BD | 352008 | Poliestireno |
| Tetramero de classe II carregado com peptídeo (conforme descrito) | Reagente | N/A | N/A | Preparado pelo núcleo de tetrameros do BRI |
| Anti-CD3 | Reagente | BD Biosciences | 347344 | Ou equivalente |
| Anti-CD4 | Reagente | eBioscience | 17-0049-73 | Ou equivalente |
| Anti-CD25 | Reagente | eBioscience | 11-0259-73 | Ou equivalente |
| Citômetro de fluxo Facs Calibur | equipamento | BD Biosciences | 342975 | Ou equivalente |
Referências
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W.
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Reimpressões e permissões
