Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.
Grote histocompatibility complex (MHC) klasse II tetrameren kan de directe visualisatie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen door flowcytometrie. Deze methode is gebaseerd op de zeer specifieke interactie tussen peptide geladen MHC en de bijbehorende T-cel-receptor. Terwijl de affiniteit van een MHC / peptide molecuul is laag, cross-linking MHC / peptide complexen met streptavidine verhoogt de aviditeit van de interactie, waardoor het gebruik ervan als kleurstoffen. Vanwege de relatief lage frequenties van de CD4 + T-cellen (~ 1 op 300.000 voor een enkele specificiteit) deze test maakt gebruik van een in vitro amplificatie stap te verhogen de drempel van de detectie. Mononucleaire cellen worden gezuiverd uit perifeer bloed door Ficoll onderlaag. CD4 + cellen worden dan van elkaar gescheiden door negatieve selectie met behulp van gebiotinyleerd antilichaam cocktail en anti-biotine gelabeld magnetische korrels. Met behulp van hechtende cellen van de CD4-cel-fractie als antigeen presenterende cellen, CD4 + T-cellen zijn uitgebreid in de media door het toevoegen van een antigene peptiden-en IL-2. De uitgebreide cellen zijn gekleurd met de bijbehorende klasse II tetrameer door incubatie bij 37 C gedurende een uur en daarna gekleurd met oppervlakte-antilichamen zoals anti-CD4, anti-CD3 en anti-CD25. Na de etikettering, kunnen de cellen direct worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie. De tetrameer positieve cellen vormen meestal een aparte bevolking onder de uitbreiding van CD4 + cellen. Tetrameer positieve cellen zijn meestal CD25 + en CD4 vaak hoog. Omdat het niveau van achtergrond tetrameer vlekken kan variëren, moet positieve kleuring resultaten altijd worden vergeleken met de kleuring van dezelfde cellen met een irrelevante tetrameer. Meerdere variaties van deze fundamentele test zijn mogelijk. Tetrameer positieve cellen kunnen worden gesorteerd voor verdere fenotypische analyse, opname in ELISPOT of proliferatie assays, of andere secundaire testen. Verschillende groepen hebben ook aangetoond dat co-kleuring met behulp van tetrameren en ofwel anti-cytokine of anti-Foxp3 antilichamen.
Begrijpen van de rol van CD4 + T-cellen in de immuniteit is van fundamenteel belang. Echter, antigeen specifieke CD4 + T-cellen zijn moeilijk te detecteren en het gebruik van traditionele methoden te isoleren. In tegenstelling, MHC klasse II tetrameren kan de directe visualisatie van de CD4 + T-cellen met de gewenste antigen specificiteit. Deze video toont de isolatie, zuivering, en in-vitro-amplificatie van CD4 + T-cellen en de daaropvolgende visualisatie met behulp van tetrameren. Klasse II tetrameren zijn fluorescere…
Wij danken Dick Foley en Leigh Kimball voor hun belangrijke rollen in film en video productie.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |