Antigène spécifique de CD4 + Visualisation cellules T à l'aide du CMH de classe II tétramères

Summary

Cette procédure montre la purification et l'expansion in vitro des cellules CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T du sang périphérique entier et leur visualisation en utilisant des tétramères CMH de classe II. Tétramères permettent la visualisation directe des cellules T avec une spécificité antigénique unique et défini CMH de classe II restriction.

Abstract

Complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T par cytométrie en flux. Cette méthode repose sur l'interaction entre le peptide hautement spécifique chargée du CMH et les correspondants récepteur des cellules T. Alors que l'affinité d'un seul CMH / peptide molécule est faible, la réticulation des complexes CMH / peptide avec la streptavidine augmente l'avidité de l'interaction, permettant leur utilisation comme réactifs coloration. En raison de la fréquence relativement faible des lymphocytes T CD4 + (~ 1 300 000 en une seule spécificité) ce test utilise une étape de l'amplification in vitro d'augmenter son seuil de détection. Des cellules mononucléaires sont purifiés à partir du sang périphérique par la sous-couche de Ficoll. Cellules CD4 + sont ensuite séparés par une sélection négative utilisant un cocktail d'anticorps biotinylé et d'anti-biotine billes magnétiques. En utilisant des cellules adhérentes de la fraction de cellules CD4 que cellules présentatrices d'antigènes, cellules T CD4 + sont développées dans les médias par l'ajout d'un peptide antigénique et de l'IL-2. Les cellules sont colorées avec élargi correspondant de classe II tétramère en incubant à 37 ° C pendant une heure et ensuite colorées à l'aide d'anticorps de surface tels que l'anti-CD4, anti-CD3 et anti-CD25. Après marquage, les cellules peuvent être directement analysées par cytométrie en flux. Les cellules positives tétramère se forment généralement une population distincte parmi les CD4 + cellules élargi. Cellules tétramère positifs sont généralement CD25 + CD4 et souvent élevé. Parce que le niveau de coloration tétramère de fond peut varier, les résultats coloration positive doit toujours être comparée à la coloration des cellules mêmes avec un tétramère pertinent. Multiples variantes de ce test de base sont possibles. Cellules tétramère positifs peuvent être triées pour l'analyse phénotypique d'autres, l'inclusion dans ELISPOT ou de tests de prolifération, ou d'autres épreuves du secondaire. Plusieurs groupes ont également démontré la co-marquage utilisant des tétramères et soit anti-cytokine et anti-FoxP3 anticorps.

Protocol

1. Sang périphérique de cellules mononucléaires (PBMC) isolement Obtenir un échantillon de sang – le sang doit être recueilli dans des seringues ou des tubes de sang et d'anti-coagulant par l'héparine (1:50 ratio) pour empêcher la coagulation. Attendez-vous à un rendement d'environ 1 × 10 6 PBMC par ml de sang – environ 40% de ce qui sera CD4 positifs (CD4 +) des cellules T. Aliquoter le sang dans 50 ml tubes coniques, 25 ml par tube. Si le sang a séparé, mélanger …

Discussion

Comprendre le rôle des cellules T CD4 + dans l'immunité est fondamentalement important. Toutefois, CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T peut être difficile à détecter et d'isoler à l'aide des méthodes traditionnelles. En revanche, CMH de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules T CD4 + à la spécificité de l'antigène désiré. Cette vidéo montre l'isolement, la purification et l'amplification in vitro des cellules T CD4 + et leur visualisa…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Forma	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	HyClone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning/Costar	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalgene	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo Scientific	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD pharmingen	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent