この手順では、精製および抗原特異的CD4 + MHCクラスIIテトラマーを用いて全末梢血とその可視化から、T細胞のin vitroでの展開の例を示します。四量体は、単一の抗原特異性と定義されているMHCクラスII制限とT細胞の直接可視化を可能にする。
主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIIテトラマーは、抗原特異的CD4 +フローサイトメトリーによるT細胞の直接可視化を可能にする。このメソッドは、ペプチドロードされたMHCと対応するT細胞受容体との間の非常に特異的な相互作用に依存しています。単一MHC /ペプチド分子の親和性は低いですが、ストレプトアビジンとMHC /ペプチド複合体を架橋する染色試薬としての利用を可能にする、相互作用の結合力を増加させる。ためにCD4 + T細胞(単特異性30万で〜1)の比較的低い周波数からこのアッセイでは検出のしきい値を高めるためにin vitroでの増幅工程に使用しています。単核細胞をFicollの下敷きにより末梢血から精製されています。 CD4 +細胞は、その後、ビオチン化抗体カクテルとAnti – Biotin標識した磁気ビーズを用いてネガティブセレクションによって分離される。抗原提示細胞、CD4 + T細胞は抗原ペプチドとIL – 2を追加することで、メディアで展開されるようにCD4細胞分画から接着細胞を使用する。拡張された細胞は、抗CD4、抗CD3および抗CD25などの表面の抗体を用いて一時間、その後、ステンドグラス、37℃でインキュベートすることにより、対応するクラスIIテトラマーで染色されています。標識後、細胞を直接フローサイトメトリーによって分析することができます。テトラマー陽性細胞は、通常、拡張されたCD4 +細胞の間で明確な集団を形成する。テトラマー陽性細胞は、通常、CD25 +と頻繁にCD4高い。バックグラウンドのテトラマー染色のレベルが異なる場合があるため、陽性染色の結果は常に無関係の四量体と同じ細胞の染色と比較する必要があります。この基本的なアッセイの複数のバリエーションが可能です。テトラマー陽性細胞は、さらに表現型解析、ELISPOTまたは増殖アッセイに含める、または他の二次アッセイのためにソートすることができる。いくつかのグループはまた、四量体と抗サイトカインや抗Foxp3の抗体のいずれかを使用して共同で染色を実証している。
免疫にCD4の役割+ T細胞を理解することは基本的に重要である。しかしながら、抗原特異的CD4 + T細胞が検出し、従来の方法を使用して分離することが困難な場合があります。対照的に、MHCクラスIIテトラマーは、所望の抗原特異性とCD4 + T細胞の直接可視化を可能にする。このビデオでは、分離、精製、およびCD4 + T細胞および四量体を使用して、その後の可視化のin vitro増幅を示しています。ク…
私たちは、撮影とビデオ制作におけるそれらの重要な役割のためにディックフォーリーやリーキンボールに感謝。