이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.
Abstract
주요 histocompatibility 복합 (MHC) 클래스 II의 tetramers은 항원 특정 CD4의 직접적인 시각화 + 유동세포계측법에 의해 T 세포 수 있습니다. 이 방법은 펩타이드로드 MHC와 해당 T – 세포 수용체 사이의 매우 구체적인 상호 작용에 의존합니다. 하나 MHC / 펩티드 분자의 친화력이 낮은 반면, 교차 연결 streptavidin과 MHC / 펩타이드 단지하면 시약을 얼룩로서 사용할 수 있도록, 상호 작용의 욕망을 증가시킵니다. 때문에 CD4 + T 세포 (단일 특이성을위한 300,000의 ~ 1)의 상대적으로 낮은 주파수의 분석은 검출 자사의 한계를 높이기 위해 체외 증폭 단계에서을 활용합니다. Mononuclear 전지는 Ficoll의 밑받침에 의해 말초 혈액 정화됩니다. CD4 + 세포는 다음 biotinylated 항체 칵테일 및 안티 – 비오틴 분류 자석 구슬을 사용하여 부정적인 선택으로 구분됩니다. 항원은 세포, CD4 + T 세포가 antigenic의 펩타이드와 IL – 2를 추가하여 미디어 확장된다 제시로 CD4 세포 분획에서 자기편 세포를 사용합니다. 확대 세포 한 시간 동안 37 C의 잠복기와 이후 스테인드 같은 안티 – CD4, 안티 인 경우에는 3 번 CD, 및 안티 CD25와 같은 표면 항체를 사용하여 해당 클래스 II tetramer 물들일 수 있습니다. 라벨 후, 세포를 직접 유동세포계측법으로 분석하실 수 있습니다. tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 확장된 CD4 + 세포들 사이에 뚜렷한 인구를 형성합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은. 배경 tetramer의 얼룩의 수준이 다를 수 있기 때문에, 긍정적인 얼룩 결과는 항상없는 tetramer와 같은 세포의 얼룩에 비해해야합니다. 이 기본 분석의 여러 변형이 가능합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 더욱 phenotypic 분석, ELISPOT 또는 확산 assays에 포함 또는 기타 보조 assays에 대한 정렬 수 있습니다. 몇몇 그룹은 또한 tetramers 및 안티 시토킨 또는 방지 FoxP3 항체 중 하나를 사용하여 공동 얼룩을 증명하고있다.
Protocol
1. 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC) 절연 혈액 샘플을 구합니다 – 피를 주사기 혹은 혈액 튜브의 수집과 염증을 방지하기 위해 헤파린 (1시 50분 비율)과 함께 안티 coagulated해야합니다. 약 1 × 혈액 ML 당 10 6 PBMC의 수율을 기대 – CD4 양성 (CD4 +) T 세포 될 약 40 % 중. 50 ML 원뿔 튜브, 튜브 당 25 ML로 나누어지는 혈액을. 혈액이 분리된 경우, 부드럽게 플라즈마를 배포하기 전에 aliquoting…
Discussion
면역의 CD4의 역할 + T 세포를 이해하는 것이 근본적으로 중요하다. 그러나, 특정 항원 CD4 + T 세포가 감지하고 전통적인 방법을 사용하여 분리하기가 어려울 수 있습니다. 대조적으로, MHC 클래스 II의 tetramers 원하는 항원 특이성과 CD4 + T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다. 이 동영상은 고립, 정화하고, CD4 + T 세포와 tetramers를 사용하여 후속 시각화의 체외 증폭에을 보여줍니다. 클래스 II의 Tetrame…
James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers. J. Vis. Exp. (25), e1167, doi:10.3791/1167 (2009).