Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Summary

Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.

Abstract

Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode basiert auf der hoch spezifische Wechselwirkung zwischen Peptid beladenen MHC und die entsprechenden T-Zell-Rezeptor. Während die Affinität eines einzelnen MHC / Peptid-Molekül ist gering, Vernetzung MHC / Peptid-Komplexe mit Streptavidin erhöht die Avidität der Interaktion, so dass ihre Verwendung als Färbereagenzien. Wegen der relativ niedrigen Frequenzen von CD4 + T-Zellen (~ 1 in 300.000 für einen einzigen Spezifität) diesen Test nutzt eine in vitro-Amplifikation Schritt zu seiner Schwelle Erkennung zu erhöhen. Mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut durch Ficoll Unterlage gereinigt. CD4 + Zellen werden dann durch negative Selektion mittels biotinylierten Antikörper-Cocktail und anti-Biotin markiert magnetische Kügelchen getrennt. Mit adhärenten Zellen aus der CD4-Zell-Fraktion als Antigen-präsentierende Zellen, CD4 + T-Zellen werden in Medien, indem eine antigene Peptid-und IL-2 erweitert. Die expandierten Zellen sind mit der entsprechenden Klasse II Tetramer durch Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde und anschließend gefärbt mit Oberfläche Antikörper wie anti-CD4, anti-CD3 und anti-CD25 gefärbt. Nach der Etikettierung können die Zellen direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Das Tetramer-positiven Zellen bilden typischerweise eine deutliche Bevölkerung unter den erweiterten CD4 +-Zellen. Tetramer-positiven Zellen sind in der Regel CD25 + CD4 und oft hoch. Da der Pegel der Hintergrundgeräusche Tetramer-Färbung kann variieren, sollten positive Färbung Ergebnisse immer auf die Färbung von den gleichen Zellen mit einem irrelevanten Tetramer verglichen werden. Mehrere Variationen dieses grundlegende Assay sind möglich. Tetramer-positive Zellen können für weitere phänotypische Analyse, Aufnahme in ELISPOT oder Proliferation Assays oder andere sekundäre Assays sortiert werden. Mehrere Gruppen haben auch Co-Färbung mit Tetrameren und entweder Anti-Zytokin-oder Anti-FoxP3 Antikörper nachgewiesen.

Protocol

1. Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) isoliert Besorgen Sie sich eine Blutprobe – Blut sollte in Spritzen oder Blut-Röhrchen gesammelt und anti-koaguliert mit Heparin (1:50 ratio) Gerinnen zu verhindern. Erwarten Sie eine Ausbeute von etwa 1 × 10 6 PBMC pro ml Blut – etwa 40% davon werden CD4 positive (CD4 +) T-Zellen sein. Aliquot dem Blut in 50 ml konische Röhrchen, 25 ml pro Röhrchen. Wenn Blut getrennt hat, sanft vor Aliquotierung Mix, um das Plasma zu verteilen Add P…

Discussion

Verständnis der Rolle der CD4 + T-Zellen im Immunsystem ist von grundlegender Bedeutung. Allerdings können Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen schwer zu erkennen und zu isolieren, die mit traditionellen Methoden. Im Gegensatz dazu erlauben MHC-Klasse-II-Tetramere die direkte Visualisierung von CD4 + T-Zellen mit der gewünschten Antigen-Spezifität. Dieses Video zeigt die Isolierung, Reinigung und In-vitro-Amplifikation von CD4 + T-Zellen und deren anschließende Visualisierung mit Tetrameren. Klasse II Tetramere sind…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Forma	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	HyClone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning/Costar	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalgene	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo Scientific	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD pharmingen	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent