Измерение экзоцитоза в Нейроны Использование FM-маркировки

Summary

Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены красным флуоресцентным красителем FM 4-64 для измерения скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков в гиппокампе нейронов культур.

Abstract

Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены FM краситель для контроля скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков. FM4-64 представляет собой красный флуоресцентный амфифильных стирил краситель, который встраивается в мембраны синаптических пузырьков как эндоцитоза стимулируется. Липофильные взаимодействия причиной красителя значительно увеличить флуоресценции, таким образом, излучающие яркий сигнал, когда связанные с пузырьками и номинальной, когда во внеклеточной жидкости. После мытья шаг используется, чтобы помочь устранить внешние красителя в плазме мембраны, оставшиеся FM сосредоточен в пузырьках, а затем изгнали когда экзоцитоза индуцирована очередной раунд электрической стимуляции. Скорость выделения пузырьков измеряется от последующем снижении флуоресценции. С FM красителя может быть применено внешнее и скоротечно, это полезный инструмент для установления ставок экзоцитоз в нейрональных культурах, особенно при сравнении ставок между трансфицированных синапсов и соседних boutons контроля.

Protocol

Клетки: Крыса (или мыши) первичных нейронов гиппокампа культур (14-28 дней в пробирке). Стимуляция: Электрическое, доставляется через двумя платиновыми электродами; 70-90 мВ Микроскопия: 60x объектив нефти на перевернутую ПЗС-флуоресцентного микроскопа. <p class=…

Discussion

Как 300 потенциалов действия (AP) является достаточным, чтобы вызвать по меньшей мере один раунд пузырьков переработки, загрузки стимулом 300 точек или более часто дают этикетку переработки пул везикул. Хотя более интенсивной загрузки стимулы, такие как 900 точек доступа, может позволить номинальный р?…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
APV		Sigma	A5282
FM 4-64		Molecular Probes	T-3166
CNQX disodium salt		Sigma	C-239