Homarus Americanus Stomatogastric तंत्रिका तंत्र विच्छेदन

Summary

हम अमेरिकी लॉबस्टर के पेट से stomatogastric तंत्रिका तंत्र के ठीक विच्छेदन वर्णन (<i> Homarus americanus</i>).

Abstract

समझ तंत्रिका प्रणाली कैसे गतिविधि उत्पादन और पर्यावरण के लिए जवाब के लक्ष्य के साथ, neuroscientists मॉडल प्रणाली है कि ब्याज की गतिविधि प्रदर्शन और सुलभ और प्रयोगात्मक विधियों के लिए उत्तरदायी हैं करने के लिए बारी है. अमेरिकी लॉबस्टर की stomatogastric तंत्रिका प्रणाली (STNS) (<i> Homarus americanus</i>, यह भी पता है कि अटलांटिक या मेन लॉबस्टर था) नेटवर्क और नेटवर्क के neuromodulation पैदा ताल के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया है. STNS 3 पूर्वकाल (2 commissural ganglia और एक oesophageal नाड़ीग्रन्थि) ganglia, modulatory न्यूरॉन्स कि stomatogastric नाड़ीग्रन्थि (STG) के लिए केन्द्र परियोजना युक्त होते है. STG लगभग 30 न्यूरॉन्स कि दो केंद्रीय पैटर्न पैदा नेटवर्क शामिल है, जठरनिर्गम और गैस्ट्रिक नेटवर्क है कि क्रसटेशियन में खिला व्यवहार आबाद हैं<sup1,2></sup>. हालांकि यह संभव है करने के लिए इस प्रणाली का अध्ययन<i> Vivo में</i³ STNS जब पृथक करने के लिए अपने लयबद्ध गतिविधि उत्पादन जारी<i> इन विट्रो में</i>. एक डिश में STNS की शारीरिक अलगाव intracellular electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए ganglia में somata और बाह्य रिकॉर्डिंग के लिए STNS की नसों को आसान पहुँच के लिए अनुमति देता है. अलग STNS एक दो भाग प्रक्रिया है. पहले भाग, जानवर से पेट विदारक, एक साथ वीडियो लेख में वर्णित है⁴. इस वीडियो लेख में, ठीक विच्छेदन तकनीक पेट से STNS अलग उपयोग किया जाता है. यह प्रक्रिया एक तंत्रिका तंत्र की तैयारी है कि electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए उपलब्ध है में परिणाम है.

Protocol

इस प्रोटोकॉल शुरुआत करने के लिए पहले लॉबस्टर के पेट जानवर से हटा दिया जाना चाहिए और तैयार के रूप में साथी जौव लेख (Bierman और Tobin, 2009) में वर्णित है. नीचे उल्लिखित चरणों के बहुमत के लिए एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे प्रदर्शन हो रहे हैं. पार्ट Commissural ganglia मैं अलग ओरिएंट पकवान इतनी है कि पूर्वकाल अंत (होंठ के द्वारा) आप और पीछे अंत (जठरनिर्गम द्वारा) से दूर है, आप की ओर है. सुनिश्चित करें कि पेट टिकी है ताकि यह पकवान पर के रूप में संभव के रूप में में फ्लैट झूठ. नीचे होंठ के प्रत्येक पक्ष पर घुटकी पिन. यदि आवश्यक हो, अन्य सकल विच्छेदन के दौरान रखा पिन को पुनर्व्यवस्थित. Hypodermis निकालें. Gm2/gm3 मांसपेशियों के पास hypodermis ले लो, यह इन मांसपेशियों से अलग और धीरे पूर्वकाल दिशा में खींच. अंतर्निहित वसा से किसी भी कनेक्शन snipping द्वारा hypodermis अलग. का प्रयोग करें केंद्रीय धमनी है, जो stomatogastric तंत्रिका तंत्र का एक महत्वपूर्ण हिस्सा encloses आसपास देखभाल में वृद्धि हुई. Stomatogastric नाड़ीग्रन्थि के एक 0.5 सेमी त्रिज्या, जो gm1b मांसपेशियों के बीच बैठता है के बारे में भीतर बरकरार hypodermis छोड़ो. से अलग hypodermis कट. अंतर्निहित ऊतकों से मस्तिष्क अलग. दो बड़े commissural नसों कि मस्तिष्क के पूर्वकाल भाग से द्विपक्षीय पेट के पूर्वकाल भाग में commissural ganglia के लिए परियोजना को पहचानें. इन तंत्रिकाओं बरकरार छोड़कर, संदंश के साथ धीरे मस्तिष्क लिफ्ट और ऊतक के बाकी हिस्सों से अलग मस्तिष्क में कटौती. सावधान के रूप में आप इस करते रहो, के रूप में stomatogastric तंत्रिका मस्तिष्क के नीचे है और बरकरार रखा जाना चाहिए. ऊतक आसपास से अलग commissural ganglia. Commissural ganglia के एक commissural नसों का पालन करें. आयन और बेटे को पहचानें – इन तंत्रिकाओं बरकरार रहना चाहिए . commissural नाड़ीग्रन्थि कई बाहर radiating नसों होगा. उनमें से ज्यादातर कट (आयन और बेटे को छोड़कर), लेकिन एक अतिरिक्त जगह में commissural नाड़ीग्रन्थि पकड़ जब तुम विच्छेदन खत्म संलग्न तंत्रिका छोड़ . अन्य commissural नाड़ीग्रन्थि के साथ दोहराएँ. और पार्श्व से औसत दर्जे के लिए आयन बेटे साफ़. ओष्ठ तंत्रिका पेट के लिए तंत्रिका तंत्र लंगर बरकरार छोड़ दें. esophageal नाड़ीग्रन्थि थे आयन एस प्रतिच्छेद बैठता है. आप इसे नीचे अवर निलय तंत्रिका हथियाने और खींच के नीचे कटौती करके स्पष्ट कर सकते हैं. भाग द्वितीय – अलग Stomatogastric (STG) नाड़ीग्रन्थि और शेष नसों. STG ऊतक आसपास से अलग करें. STG एक धमनी है कि gm1b मांसपेशियों और gm2a, ख की मांसपेशियों के लिए नीचे के बीच रन के अंदर बैठता है. Gm2a, ख मांसपेशियों के पास धमनी की कटौती के अंत के लिए देखो. धमनी की कटौती अंत तक और पूर्व से खींचो, dvn बेनकाब करने के लिए. खींच जब तक आप शेष hypodermis के स्तर तक पहुँचने जारी रखें. अलग एक बार, धमनी स्तर जहां यह शेष hypodermis छू करने के लिए छंटनी की जा सकती है. कट मांसपेशियों प्रालंब है कि झींगा के व्याख्यान चबूतरा में स्थित था. धमनी ऊपर hypodermis लिफ्ट, देख रहा है कि धमनी STG ऊपर वसा अंदर एक सुरंग बनाता है. धमनी के अंदर अपने कैंची की एक ब्लेड रखो और यह ऊपर की मांसपेशी में कटौती. Check कि आप dvn देखने के रूप में आप को यकीन है कि आप सुरक्षित STG ऊपर हैं कटौती कर सकते हैं. पूर्व से काटने धमनी के बाद, जारी रखें. जैसा कि आप STG ऊपर में कटौती, आप STN STG और मांसपेशियों में गोताखोरी नीचे से पूर्व से उत्पन्न देखने के लिए सक्षम हो जाएगा . पूर्व से काटने STG ऊपर पूरी तरह से मांसपेशी अलग जारी रखें. किसी भी ऊतक STN से दूर रिक्त करें. आसपास के ऊतकों से AGN एस अलग. (यहां तक कि अगर आप AGN से रिकॉर्ड करने की योजना नहीं है, तो आप बरकरार तंत्रिका के एक हिस्से की आवश्यकता करने के लिए नीचे रिकॉर्डिंग के लिए intracellular नाड़ीग्रन्थि पिन होगा.) बेहतर AGN एस करने के लिए, शेष hypodermis और अंतर्निहित मांसपेशियों की एक पतली परत को हटा दें. बस STG के लिए पीछे हैं, और dvn के दोनों तरफ वसा की मांसपेशी में एक अंधेरी सुरंग की पहचान . एक सुरंग के अंदर कैंची ब्लेड चिपके रहते हैं और तंत्रिका ऊपर ऊतक में कटौती. Laterally काटने जारी रखें, तंत्रिका के बाद, यह अलग है. (एक जोड़ी मिलीमीटर नाड़ीग्रन्थि लगाए करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन यदि आप इसे से रिकॉर्ड करने की योजना AGN के कम से कम 5 मिमी बेनकाब.) मांसपेशी यह innervates से कनेक्शन काटने से AGN अलग. दूसरी तरफ दोहराएँ अन्य AGN अलग. एक बार दोनों AGN dissected किया गया है, सभी मांसपेशियों और ऊतकों पेट के लिए STG को जोड़ने में कटौती. Mvn एस पृथक वे छोटे नसों के बंद LVN शाखाओं में बंटी और वसा नीचे laterally traversing द्विपक्षीय जोड़ी हैं. या तो कैंची या दो संदंश का उपयोग dvn के एक तरफ वसा के माध्यम से कटौती, के पास जहां यह दो LVN एस में शाखाएं यहाँ आप mvn एस से दूर कर रहे हैं और जोखिम उन्हें काटने नहीं होगा. मोटी परत लिफ्ट, और छोटे mvn नीचे की पहचान. इन तंत्रिकाओं laterally बस gm1b मांसपेशियों के स्तर के लिए पीछे औसत दर्जे चलाते हैं. Mvn ऊपर वसा की परत को हटाएँ, तंत्रिका बरकरार अब के लिए तो यह उलझ नहीं हो जाएगा छोड़ने . आप पेट बंद से विच्छेदन के अंत में अपने पार्श्व अंत में कटौती करेगा. दूसरी तरफ प्रक्रिया को दोहराएँ अन्य mvn अलग. LVN और पीछे नसों पृथक. शुरू जहां LVN शाखा के laterally dvn बंद, यह ऊपर वसा काटने से एक LVN का पालन करें. तैयारी पर निर्भर करता है, कभी कभी पूरे मोटी परत तंत्रिका ऊपर बंद खींचा जा सकता है. बिंदु जहां PSN शाखाएं बंद तक खुलासा LVN जारी रखें . Pyn पृथक. Pyn का पता लगाएँ, यह एक तंत्रिका जठरनिर्गम अधिक पीछे यात्रा है. पतली झिल्ली इस क्षेत्र को कवर निकालें. जठरनिर्गम का एक छोटा सा वर्ग pyn से जुड़ी काटने से pyn अलग. धीरे जठरनिर्गम अनुभाग उठा और pyn के दोनों तरफ दूर ऊतक में कटौती जब तक आप शाखा है कि PDN को देता है तक पहुँचने . PDN पृथक. PDN का पता लगाएँ, यह एक तंत्रिका जठरनिर्गम फैलनेवाली पेशी मांसपेशियों को पीछे यात्रा है. जठरनिर्गम फैलनेवाली पेशी मांसपेशियों के एक छोटे अनुभाग, PDN से जुड़ी कट. धीरे जठरनिर्गम फैलनेवाली पेशी मांसपेशियों अनुभाग लिफ्ट, PDN के दोनों तरफ दूर ऊतक में कटौती जब तक आप शाखा है कि pyn को देता है तक पहुँचने . उदर LVN, कि LVN pyn और PDN को जोड़ता पृथक . त्रिकोणीय शाखा बिंदु जहां pyn और PDN वेंट्रल LVN से कनेक्ट करने में, तंत्रिका के किसी भी छोटे अनुभाग अलग है कि उदर LVN बंद vpln शाखाओं, जैसे . यह एक संभाल के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा वेंट्रल LVN पर पुल. संभाल पर लिफ्ट और उदर LVN के दोनों ओर दूर पर ऊतक में कटौती, पूर्वकाल दिशा में काम कर रहे जब तक आप बिंदु तक पहुँचने जहां PSN शाखाएं बंद. 10 चरणों को दोहराएँ – 13 के लिए दूसरी तरफ LVN और पीछे नसों को अलग . पेट से stomatogastric तंत्रिका तंत्र अलग. पूरी तरह से पेट से LVN अलग करने के लिए, PSN पर खींचने के लिए और सभी ऊतक और नसों LVN और उदर LVN PDN और pyn के लिए छोड़कर, संलग्न कटौती. दूसरी तरफ इस प्रक्रिया को दोहराएँ. प्रत्येक mvn के पार्श्व अंत कट. पार्श्व अंत लिफ्ट और तंत्रिका और अंतर्निहित पेट के ऊतकों के बीच किसी भी बाहरी संलग्नक में कटौती. पूर्वकाल अंत में, commissural ganglia में किसी भी बाहरी संलग्नक में कटौती, और प्रत्येक पक्ष पर ओष्ठ तंत्रिका में कटौती. दिखने stomatogastric तंत्रिका तंत्र की पहचान करने और फिर पेट के ऊतकों को किसी भी अतिरिक्त संलग्नक में कटौती सिस्टम को स्कैन. दोनों commissural नसों के पूर्वकाल अंत पर ले लो, commissural ganglia के ऊपर, और पेट बंद stomatogastric तंत्रिका तंत्र छील और यह पकवान की तरफ कदम. जैसा कि आप इस करते हैं, किसी भी शेष संलग्नक कटौती करने के लिए तंत्रिका तंत्र को मुक्त. छोटे Sylgard पकवान तैयार है. Sylgard की सतह पर छोटे डिश में कुछ पेट के ऊतकों को अच्छी तरह रगड़ो. यह Sylgard के hydrophobicity कमी, ताकि खारा पकवान समान रूप से भर में वितरित करेंगे. कुल्ला और ठंडा नमक के साथ Sylgard पकवान भरने. दोनों commissural नसों के पूर्वकाल छोर हथियाने, तंत्रिका तंत्र उठाने बड़ी डिश के बाहर, और यह छोटे डिश में बिछाने से तैयार Sylgard पकवान करने के लिए तंत्रिका तंत्र का स्थानांतरण. Minuten पिन और पतले पिन टंगस्टन तार से कटौती का एक संयोजन का उपयोग कर छोटे डिश में STNS पिन. सुनिश्चित करें कि तैयारी पृष्ठीय पक्ष जाँच है कि अवर निलय तंत्रिका Sylgard से दूर ओर इशारा करते है. मस्तिष्क निकालें और commissural नसों पिन. धीरे तंत्रिका तंत्र तंग और PSN एस के प्रत्येक पीछे खींच और laterally, और उन्हें नीचे लगाए फ्लैट खींचो. PDN से जठरनिर्गम फैलनेवाली पेशी मांसपेशियों निकालें, और PDN एस पिन हटानाpyn से जठरनिर्गम खंड, और pyn एस पिन नीचे ओष्ठ नसों के रूप में किसी भी शेष पृथक नसों पिन, mvn और AGN एस STG Desheath. सुनिश्चित करें STG Sylgard के खिलाफ फ्लैट है और पार्श्व AGN एस, STN पूर्वकाल और कूल्हों dvn द्वारा तना हुआ आयोजित. प्रकाश व्यवस्था व्यवस्थित dvn भीतर axons की दृश्य सक्षम करने के लिए. एक छोटा सा पिन या ठीक टंगस्टन सुई का प्रयोग, dvn, बस STG के लिए पीछे के आसपास म्यान में एक छोटे उथले छेद बनाते हैं. Dvn भर में सुई खींचो, axons करने के लिए पृष्ठीय, तंत्रिका म्यान में एक क्षैतिज आंसू बनाने. तंत्रिका म्यान STG के लिए पीछे की प्रालंब पकड़ो और पूर्व से खींच STG के पृष्ठीय तरफ से म्यान हटायें. लघुरूप: STNS Stomatogastric तंत्रिका तंत्र STG Stomatogastric नाड़ीग्रन्थि दांता Commissural नाड़ीग्रन्थि STN stomatogastric तंत्रिका mvn औसत दर्जे का निलय तंत्रिका आयन अवर oesophageal तंत्रिका बेटा बेहतर oesophageal तंत्रिका AGN पूर्वकाल गैस्ट्रिक तंत्रिका dvn पृष्ठीय निलय तंत्रिका LVN पार्श्व निलय तंत्रिका PSN पीछे पेट तंत्रिका vpln उदर पीछे पार्श्व तंत्रिका pyn जठरनिर्गम तंत्रिका PDN जठरनिर्गम फैलनेवाली पेशी तंत्रिका

Discussion

लॉबस्टर पेट और STNS का शरीर रचना विज्ञान अच्छी तरह से ^किया गया है 5,6 पहले से वर्णित है, और इस विच्छेदन प्रक्रिया के बदलाव के कई अध्ययनों में उपयोग किया गया है. हम ^5-7 और पहले शुरुआत dissections STNS ^5,8 पेट की शारीरिक रचना के साथ परिचित बनने की सलाह देते हैं. इस तरह परिचित नसों और ऊतकों को आकस्मिक नुकसान के जोखिम को कम करेगा.

तैयारी के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए, यह करने के लिए एक ठंडे तापमान पर तैयार बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. यह आसानी से खारा 4 के साथ हर 30 मिनट ˚ सी खारा एक रेफ्रिजरेटर में रखा का आदान प्रदान करके हासिल की है. जब ठंड खारा में डूबे, पृथक STNS तैयारी कई घंटे के लिए व्यवहार्य है. STG से संबंधित Homarus gammarus में रिकॉर्डिंग स्थिर लयबद्ध गतिविधि का प्रदर्शन किया है, ⁹ इन विट्रो में 5 दिनों के दौरान इसी तरह की मजबूती एच. में देखा गया है americanus (OBS pers.).

Modulatory commissural ganglia से STG करने के लिए इनपुट के लिए चल रहे मोटर पैटर्न के संरक्षण की आवश्यकता है. इसलिए, एक सामान्य लयबद्ध गतिविधि इन ganglia और आयन बेटे को बनाए रखने के लिए, और STN नसों बरकरार रखा जाना चाहिए. विच्छेदन हम वर्णन कई मोटर तंत्रिकाओं (मोटर न्यूरॉन axons युक्त) को बरकरार रखता है: AGN एस (गैस्ट्रिक मिल axons (जीएम) युक्त), mvn एस (पार्श्व (एलजी) गैस्ट्रिक और अवर कार्डिएक axons (आईसी) युक्त ), pyn (जठरनिर्गम न्यूरॉन axons (PY) से युक्त), PDN एस, और LVN (पार्श्व जठरनिर्गम (LP), औसत दर्जे का (एमजी) गैस्ट्रिक, एलपीजी axons के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीएम से उन युक्त (जठरनिर्गम (पीडी) axons फैलनेवाली पेशी युक्त ) पीडी और PY). अतिरिक्त नसों (या अलग) विदारक अन्य मोटर न्यूरॉन axons दर्ज किया जा सकता है. मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु के प्रत्येक व्यक्ति के प्रकार विदारक और तंत्रिका से जो मांसपेशियों रिकॉर्डिंग innervating द्वारा व्यक्तिगत रूप से दर्ज हो सकता है न्यूरॉन परियोजनाओं की है कि प्रकार है.

यह तैयारी तंत्रिका तंत्र समारोह पर ध्यान केंद्रित अध्ययन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. न्यूरॉन्स की गतिविधियों या तो somata या axons से intracellular, तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग का उपयोग कर, या बिजली के उद्यमी नसों से extracellularly रिकॉर्डिंग से दर्ज किया जा सकता है. STG न्यूरॉन्स में कई आयन चैनल आंशिक रूप से क्लोन किया गया है और mRNA मैन्युअल रूप ^से खींचा somata 10,11 से मापा जा सकता है है.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter)	Tool	California Fine Wire		Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins.
Forceps #5	Tool	FST	91150-20
Minuten Pins	Tool	FST	26002-10
Moria Spring Scissors (7mm blades)	Tool	FST	15370-52	These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company.
Petri Dish (100x15mm)	Tool	Fischer	08-757-12	Fill 2-4mm with Sylgard 182.
Sylgard 182	Outro	Dow Corning	182
Pin Holder	Tool	FST	26018-17	Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone.
Super fine forceps #5SF	Tool	FST	11252-00
Tungsten Needles	Tool	FST	10130-05	Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire.
Dissection microscope