Un metodo semplice, economico ed efficace per preparare gli embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi è presentato. Il nostro protocollo prevede l'umidità e lo scambio di gas e non comprimere l'embrione di Drosophila. Questo metodo è adatto per GFP-based di immagini dal vivo di embrioni di Drosophila utilizzando uno stereomicroscopio o microscopio composto verticale.
Proteina fluorescente verde (GFP)-base timelapse live-imaging è una tecnica potente per lo studio della regolazione genetica dei processi dinamici come la morfogenesi dei tessuti, l'adesione cellula-cellula, o morte cellulare. Embrioni di Drosophila che esprimono GFP sono prontamente ripreso utilizzando la microscopia confocale o stereoscopica. Un obiettivo di vivere-imaging protocollo è quello di minimizzare gli effetti dannosi, come la disidratazione e ipossia. Precedenti protocolli per la preparazione di embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi hanno coinvolto messa embrioni dechorionated in olio alocarburi e sandwich di loro tra un alocarburi gas-permeabile membrana e un coprioggetto<sup> 1-3</sup>. L'introduzione di compressione attraverso embrioni di montaggio in questo modo rappresenta una complicazione indesiderabile per qualsiasi analisi basata biomeccanica della morfogenesi. Il nostro metodo, che noi chiamiamo il protocollo goccia, i risultati ottimi della redditività degli embrioni durante immagini dal vivo e non richiede che gli embrioni da comprimere. In breve, il protocollo goccia comporta il posizionamento di embrioni in una goccia di olio Halocarbon che è sospeso da un coprioggetti, che è, a sua volta, fissa all'altezza desiderata in una camera umida. Oltre a fornire lo scambio di gas e prevenire la disidratazione, tale sistema sfrutta la galleggiabilità di embrioni in olio Halocarbon per evitare che finiscano fuori posizione durante l'acquisizione Timelapse. Questo video descrive in dettaglio come raccogliere e preparare gli embrioni di Drosophila per l'imaging dal vivo utilizzando il protocollo goccia. Questo protocollo è adatto per gli embrioni di imaging dechorionated utilizzando stereomicroscopia o verticale microscopio a fluorescenza composto.
Descriviamo un nuovo metodo di preparazione di embrioni di Drosophila per l'analisi di immagini dal vivo, che noi chiamiamo il protocollo goccia. Purtroppo, non è possibile utilizzare il protocollo goccia se si lavora con un microscopio invertito. In questo caso la tecnica del sandwich (come descritto nel già astratto) deve essere utilizzato e la compressione degli embrioni rimane una preoccupazione.
Negli esperimenti in cui vengono misurate la forma delle cellule e dimensione al fine …
Siamo grati per il sostegno al BHR tramite una sovvenzione Discovery e Strumenti di ricerca e Grant strumento dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC). Riconosciamo inoltre H. Oda e il Centro di Bloomington Drosophila magazzino per la fornitura di scorte genetiche che sono state usate nelle sequenze di immagini dal vivo esempio.