في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة تنسخي من الخلايا الأم الخميرة.
Abstract
الشيخوخة هي عملية التنكسية يتميز التدهور التدريجي لمكونات العضيات الخلوية ويؤدي إلى الوفاة. الخميرة في مهدها<em> السكيراء الجعوية</em> قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة ، وثبت العديد من المحددات طول العمر لتكون الخميرة المحفوظة في حقيقيات النوى متعددة الخلايا ، بما فيها الديدان والذباب والفئران<sup> 1</sup>. وقد يعاير بسبب عدم وجود الظواهر المرتبطة بالسن كميا بسهولة ، والشيخوخة في الخميرة على وجه الحصر تقريبا من خلال قياس العمر الافتراضي للخلايا في سياقات مختلفة ، مع اثنين من نماذج مختلفة تمتد الحياة في الاستعمال الشائع<sup> 2</sup>. عمر زمني يشير إلى طول الفترة الزمنية التي خلية الأم يمكن أن يعيش في حالة عدم تقسيم هدوء يشبه ، ويقترح أن تكون بمثابة نموذج للشيخوخة بعد الإنقسامية الخلايا في حقيقيات النوى متعددة الخلايا. تنسخي مدى الحياة ، في المقابل ، يشير عدد من الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم قبل الشيخوخة ، ويعتقد أن تقدم نموذجا للتقدم في السن في الخلايا النشطة mitotically. هنا نقدم بروتوكول معمم لقياس مدى الحياة تنسخي من الناشئين خلايا الخميرة الأم. هدف تمتد مقايسة تنسخي الحياة لتحديد عدد مرات كل براعم الخلية الأم. يمكن أن تكون الخلايا الأم وابنتها متباينة بسهولة من قبل ذوي الخبرة الباحث باستخدام مجهر الضوء القياسية (التكبير مجموع 160X) ، مثل Axioscope زايس 40 أو نموذج آخر للمقارنة. ويتحقق الفصل المادي بين الخلايا من خلايا والدة ابنته باستخدام micromanipulator دليل مجهزة إبرة الألياف البصرية. مختبر نموذجي سلالات إنتاج خلايا الخميرة ابنة 20-30 في تجربة واحدة من الأم وعمر يتطلب 2-3 أسابيع.
Protocol
الجزء 1 : إعداد لوحات لسلالات والتحليل مدى الحياة تنسخي هذا المقطع يصف إعداد لوحات لYEPD صلبة لاستخدامها في فترة التجربة تنسخي الحياة وإعداد خلايا الخميرة لتحليل مدى الحياة. باستخدام تقنية معق…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة لعضو الكنيست وبانكوك من مؤسسة طبية إليسون. عضو الكنيست هو باحث طبي جديد اليسون مؤسسة في الشيخوخة. نود أن نشكر Soumya Kotireddy للحصول على المساعدة أثناء التصوير.
Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209, doi:10.3791/1209 (2009).