Injection Zebrafish ventricule cérébral

Summary

Après la formation du tube neural, le neuroépithélium resserre et se replie alors que le tube se remplit de liquide céphalorachidien embryonnaires (eCSF) pour former les ventricules du cerveau embryonnaire. Nous avons développé cette technique d'injection du ventricule afin de mieux visualiser l'espace rempli de liquide, contrairement à la forme neuroépithéliales dans un embryon vivant.

Abstract

Une bonne formation de ventricule cérébral pendant le développement embryonnaire du cerveau est nécessaire pour une fonction cérébrale normale. Ventricules cérébraux sont des cavités très conservé au sein du cerveau qui sont remplis de liquide céphalo-rachidien. Dans le poisson zèbre, après la formation du tube neural, le neuroépithélium subit une série d'étranglements et les plis tout en se remplissant de liquide entraînant la formation ventricule cérébral. Afin de comprendre le processus de formation du ventricule, et les changements de forme neuroépithéliales qui se produisent au même moment, nous avions besoin d'un moyen de visualiser l'espace ventricule en comparaison avec les tissus du cerveau. Cependant, la nature de l'embryon de poisson zèbre transparent, il est difficile de différencier le tissu de l'espace ventricule. Par conséquent, nous avons développé une technique d'injection du cerveau ventricule où l'espace le ventricule est rempli d'un colorant fluorescent et imagée par microscopie à fond clair et fluorescentes. Le clair et les images fluorescentes sont ensuite traitées et superposées dans Photoshop. Cette technique permet la visualisation de l'espace ventricule avec le colorant fluorescent, en comparaison à la forme du neuroépithélium dans l'image en fond clair. D'injection ventricule cérébral chez le poisson zèbre peut être employé à partir de 18 heures après fécondation par le biais premiers stades larvaires. Nous avons utilisé cette technique largement dans nos études de la formation et la morphogenèse ventricule cérébral ainsi que dans la caractérisation des mutants morphogenèse du cerveau (1-3).

Protocol

Protocole Partie 1: Préparation pour la microinjection Préparez-vous à l'injection en tirant des aiguilles capillaire en utilisant l'aiguille extracteur Sutter Instruments. Remplissez l'aiguille avec un colorant fluorescent (comme le Texas-Red dextran). Montez l'aiguille dans un appareil de micromanipulateur et la microinjection. Couper l'aiguille à la taille appropriée à un angle de créer un embout biseauté. Mesurer…

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons comment injecter un colorant fluorescent (Texas Red dextran) dans le développement des ventricules cérébraux poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour visualiser l'espace ventricule cérébral en contraste avec le neuroépithélium environnantes et est extrêmement utile pour déterminer la forme de l'espace du ventricule, ainsi que la forme du tissu cérébral environnant. Il nous permet de mieux comprendre le processus de formation du ventricule du cerveau et du c…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	Tip One, US Scientific	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Medical Systems Research Products Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instruments		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)