Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection
Summary
Nach Neuralrohr Bildung, verengt die Neuroepithel und Falten, während der Schlauch füllt sich mit embryonalen Liquor (eCSF), um die embryonale Hirnventrikel bilden. Wir haben dieses Ventrikels Injektionstechnik zur besseren Visualisierung der Flüssigkeit gefüllten Raum im Gegensatz zu den neuro-Form in einer Live-Embryo.
Abstract
Proper Gehirn Ventrikels Bildung während der embryonalen Entwicklung des Gehirns ist für die normale Funktion des Gehirns benötigt. Hirnventrikel sind die hochkonservierten Hohlräume im Gehirn, die mit Liquor gefüllt sind. In Zebrafisch, nachdem Neuralrohr Bildung erfährt der Neuroepithel eine Reihe von Einschnürungen und Falten, während sie mit Flüssigkeit führt Gehirn Ventrikels Bildung füllt. Um den Prozess der Ventrikel Bildung und der neuro-Form verändert, dass zur gleichen Zeit auftreten zu verstehen, brauchen wir einen Weg, um den Ventrikel Raum im Vergleich zu den Hirngewebe zu visualisieren. Allerdings macht die Natur transparent Zebrafischembryonen es schwierig, das Gewebe aus der Herzkammer Raum zu unterscheiden. Deshalb entwickelten wir ein Gehirn Ventrikels Injektionstechnik, wo die Ventrikel Raum mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefüllt und bebildert von Hellfeld-und Fluoreszenz-Mikroskopie. Die Hellfeld und Fluoreszenz-Bilder werden dann bearbeitet und überlagert in Photoshop. Diese Technik ermöglicht eine Visualisierung der Ventrikel Raum mit dem Fluoreszenzfarbstoff, im Vergleich zu der Form des Neuroepithel im Hellfeld Bild. Gehirn-Ventrikel Injektion in Zebrafisch kann von 18 Stunden nach der Befruchtung durch frühe Larvenstadien eingesetzt werden. Wir haben diese Technik ausgiebig in unseren Studien des Gehirns Ventrikel Bildung und Morphogenese sowie bei der Charakterisierung von Hirn-Morphogenese-Mutanten (1-3) verwendet.
Protocol
Discussion
In diesem Video zeigen wir, wie man Fluoreszenzfarbstoff (Texas-Red Dextran) in die Entwicklung Zebrafisch Hirnventrikel zu injizieren. Diese Methode wird verwendet, um das Gehirn Ventrikels Raum im Gegensatz zu den umliegenden Neuroepithel visualisieren und ist äußerst nützlich für die Bestimmung der Form der Ventrikel Raum sowie die Form des umgebenden Hirngewebes. Es ermöglicht uns, besser zu verstehen, den Prozess des Gehirns Ventrikel Bildung und Gehirn Morphogenese im Laufe der Zeit in der Live-Embryo. Diese …
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Laura Anne Lowery, der diese Technik im Labor entwickelt danken. HS wird durch NIHMH70926 unterstützt. Jennifer Gutzman wurde von der CSBI / Merck Postdoc-Stipendium unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
Referências
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
