Данио рерио желудочков мозга инъекций
Summary
После нейронных формирование трубки, нейроэпителия сужает и складок в то время как трубка наполняется эмбриональной цереброспинальной жидкости (eCSF) с образованием эмбриональных желудочков мозга. Мы разработали эту технику инъекции желудочка лучше визуализировать заполненных жидкостью пространство в отличие от нейроэпителиальных формы в живой эмбрион.
Abstract
Правильное формирование желудочка мозга в процессе эмбрионального развития мозга необходимы для нормальной функции мозга. Желудочки мозга хорошо сохранились и полости внутри мозга, которые заполнены спинномозговой жидкости. В данио, после нейронных формирование трубки, нейроэпителия претерпевает ряд перетяжек и складок в то время как он наполняется жидкостью в результате чего мозг формирование желудочка. Для того чтобы понять процесс желудочка формирования и нейроэпителиальных меняет свою форму, которые происходят в то же время, нам нужно способ визуализации желудочка пространства по сравнению с мозговой ткани. Тем не менее, характер прозрачных эмбрионах данио делает его трудно отличить от ткани желудочка пространства. Поэтому мы разработали инъекцию желудочков мозга техники, где желудочка пространство заполнено флуоресцентным красителем и изображено светлое и люминесцентной микроскопии. Светлое и флуоресцентные изображения затем обрабатывается и накладывается в Photoshop. Этот метод позволяет для визуализации желудочка пространство с флуоресцентным красителем, по сравнению с формой нейроэпителия в образе светлого. Мозг желудочка инъекций в данио рерио могут быть использованы с 18 часа после оплодотворения до начала личиночной стадии. Мы использовали этот метод широко в наших исследованиях мозга формирование желудочка и морфогенеза, а также для характеристики мозга морфогенеза мутантов (1-3).
Protocol
Discussion
В этом видео показано, как вводить флуоресцентного красителя (Техас-красный декстрана) в развивающиеся данио желудочков мозга. Этот метод используется для визуализации пространства желудочков мозга в отличие от окружающих нейроэпителия и является чрезвычайно полезным для определен?…
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Лаура Энн Лоури, который разработал эту технику в лаборатории. HS поддерживается NIHMH70926. Дженнифер Gutzman была поддержана CSBI / Merck докторской стипендии.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
Referências
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
