Данио рерио Всего горе высокого разрешения двумя люминесцентными В Ситу Гибридизация
Summary
Всего монтирования в гибридизация является одним из наиболее широко используемых методов в биологии развития. Здесь мы представляем высоким разрешением двумя люминесцентными на месте протокол гибридизации для анализа точных выражению одного гена и для определения перекрытия выражение доменов двух генов. Мы включаем пропидий йодида ответного ядерного пятно, чтобы выделить ткани организации.
Abstract
Всего горе<em> На месте</em> Гибридизации является одним из наиболее широко используемых методов в биологии развития. Здесь мы представляем высоким разрешением двумя люминесцентными<em> На месте</em> Гибридизации протокола для анализа точных выражению одного гена и для определения перекрытия выражение доменов двух генов. Протокол представляет собой модифицированную версию стандарта<em> На месте</em> Гибридизации с использованием щелочной фосфатазы и основания, такие как НБТ / BCIP и быстрая Красный<sup> 1,2</sup>. Этот протокол использует стандартные digoxygenin и флуоресцеина меченых зондов наряду с tyramide усиления сигнала (TSA)<sup> 3</sup>. Имеющиеся в продаже TSA комплекты позволяют гибко опытно-конструкторских как флуоресценции выбросов от зеленого до дальнего красного может быть использован в сочетании с различными ядерными пятна, такие как пропидий йодида или флуоресценции иммуногистохимии для белков. TSA производит реактивные флуоресцентного подложки, которая быстро ковалентно связывается с фрагментами, как правило, остатков тирозина, в непосредственной близости от меченых антисмысловых riboprobe. В результате окрашивания моделей высокого разрешения в этом субклеточные локализации мРНК можно наблюдать с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии<sup> 3,4</sup>. Можно наблюдать зарождающейся стенограммы на хромосомные локусы, различают ядерные и цитоплазматические окрашивания и визуализации других шаблонов, таких как корковой локализации мРНК. Исследования в<em> Drosophila</em> Показывают, что примерно 70% от мРНК выставку определенные шаблоны внутриклеточной локализацией, которые часто коррелирует с функцией закодированного белка<sup> 5</sup>. В сочетании с автоматизированной реконструкции 3D конфокальной наборов данных, наш протокол позволяет детальный анализ мРНК распределение с субклеточном разрешением в целых зародышей позвоночных.
Protocol
Discussion
Протокол, представленные здесь хорошо работает с зондов, которые дают чистый сильный сигнал после окрашивания в течение 30-45 минут в обычной щелочной фосфатазы-опосредованной реакции. Перед выполнением флуоресцентные на месте протокол гибридизации, мы всегда проверяем наши зонды испо…
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить вклад Dorthe Юлих, Дженнифер Круглый и Андрей Мара в разработке этого протокола. Исследования поддержки со стороны NICHD, Американского онкологического общества и марте Dimes.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
Referências
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
