Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות
Summary
תיאור וירוס-Induced שיטה להשתקת (VIGS) הגן לדפוק למטה של ביטוי גנים<em> ניקוטיאנה benthamiana</em> עגבניות.
Abstract
התערבות RNA (RNAi) היא מאוד ספציפיות גנים והשתקת תופעה מופעלות על ידי dsRNA 1. מנגנון ההשתקה משתמשת בשני סוגים עיקריים של הרגולטורים RNA: מיקרו RNA, שהן המופק ללא חלבון גנים קידוד RNAs התערבות קצר (siRNAs). צמחים משתמשים RNAi לשלוט transposons ולהפעיל פיקוח הדוק על תהליכים התפתחותיים כגון היווצרות איברים פרח ופיתוח עלה 2,3,4. צמחים גם להשתמש RNAi להגן על עצמם מפני זיהום על ידי וירוסים. כתוצאה מכך, וירוסים רבים התפתחו מדכאי השתקה של הגן על מנת לאפשר התיישבות מוצלח שלהם של המארח שלהם 5.
Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) היא שיטה שמנצלת מנגנון המפעל RNAi בתיווך הגנה אנטי. במפעלי נגוע וירוסים ללא שינוי מנגנון מיועד במיוחד נגד הגנום הויראלי. עם זאת, עם וקטורים וירוס נושאת רצפי גנים שמקורם המארח, תהליך זה יכול להיות ממוקד ובנוסף נגד mRNAs המארח המתאים. VIGS הותאם תפוקה גבוהה גנומיקה פונקציונלית בצמחים באמצעות הצמח tumefaciens הפתוגן Agrobacterium לספק, באמצעות פלסמיד Ti שלה, וירוס רקומביננטי הנושא את כולו או חלק מרצף הגן ממוקד עבור השתקה. התפשטות הנגיף מערכתית במפעל אנדוגני RNAi מכונות לדאוג לשאר. dsRNAs המתאים הגן היעד מיוצרים ביקע מכן על ידי דייסר ribonuclease לתוך siRNAs של 21-24 נוקלאוטידים אורך. SiRNAs אלה בסופו של דבר המדריך RNA-Induced השתקה מורכבות (RISC) לבזות את התמליל היעד 2.
וקטורים שונים כבר המועסקים VIGS ואחד הנפוצים ביותר מבוסס על טבק רעשן וירוס (TRV). TRV הוא וירוס bipartite, וכפי א, כגון שונה two זנים tumefaciens משמשים VIGS. אחת נושאת pTRV1, אשר מקודד את השכפול ואת התנועה פונקציות ויראלי בעוד אחרים, pTRV2, נמלים החלבון המעיל ואת הרצף המשמש VIGS 6,7. הרכבה של ניקוטיאנה benthamiana ושתילי העגבניות בתערובת של שני זנים תוצאות ב להשתקת גנים. השתקת הגן אנדוגני phytoene (PDS) desaturase, הגורמת photobleaching, משמש לשלוט ליעילות VIGS. יצוין, עם זאת, ההשתקה של העגבניות הוא בדרך כלל פחות יעיל מאשר נ benthamiana. שפע תעתיק הרנ"א של הגן של עניין תמיד צריך להימדד על מנת להבטיח כי הגן היעד כבר ביעילות למטה מוסדר. עם זאת, הגן רצפים Heterologous מ נ benthamiana ניתן להשתמש כדי להשתיק orthologs שלהם ברוטב עגבניות ולהיפך 8.
Protocol
Discussion
Virus-Induced השתקת הגן היא שיטה המאפשרת מהירה מסכי גנטית הפוכה. זה ימנע את הדור של T-DNA או גן transposon בתיווך דפיקה-outs, אשר זמינים רק בצמחים מסוימים כמו ארבידופסיס תירס. זה גם עוקף את התהליך לארוך זמן רב של טרנספורמציה הצמח מאפשר מיקוד של גנים מרובים בו זמנית, בתנאי שיש להם ?…
Acknowledgements
אנו מודים ד"ר פטרישיה Manosalva עבור תובנות רבות ערך לה על כתב היד. המימון ניתן על ידי תוכנית הקרן הלאומית למדע הצמח הגנום, מספר פרס DBI-0605059.
Referências
- Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet. 17, 449-459 (2001).
- Carrington, J. C., Ambros, V. Role of microRNAs in plant and animal development. Science. 301, 336-338 (2003).
- Chen, X. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science. 303, 2022-2025 (2004).
- Palatnik, J. F. Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature. 425, 257-263 (2003).
- Brigneti, G. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant Journal. 31, 777-786 (2002).
- MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).
- Senthil-Kumar, M. A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing. New Phytol. 176, 782-791 (2007).
- McCullen, C. A., Binns, A. N. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 101-127 (2006).
- Rosebrock, T. R. A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity. Nature. 448, 370-374 (2007).
- Miki, D., Itoh, R., Shimamoto, K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice. Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).
- Voinnet, O. Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants. Trends Plant Sci. 13, 317-328 (2008).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Kumar-Dinesh, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Liu, E., Page, J. E. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant. Methods. 4, 5-5 (2008).
