Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF
Summary
Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).
Abstract
Refletância interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma técnica que permite o estudo dos eventos que acontecem na membrana celular, pela imagem seletiva de moléculas fluorescentes que são mais próximos a uma substância de alto índice de refração, como vidro<sup> 1</sup>. Neste artigo, nós aplicamos essa técnica para exocitose imagem de vesículas sinápticas em células da retina bipolar isolado da retina goldfish. Esses neurônios são muito adequados para esse tipo de estudo, devido à sua terminais dos axônios de grande porte. Ao mesmo tempo patch clamping as células bipolares, é possível investigar a relação entre pré-sináptica de tensão e liberação sináptica<sup> 2,3</sup>. Vesículas sinápticas no interior da célula bipolar terminais são carregados com um corante fluorescente (FM 1-43 ®) por co-puffing o corante e uma solução contendo um toque de alto K<sup> +</sup> Concentração para os terminais sinápticos. Este despolariza as células e estimula a endocitose e conseqüente captação de corante em vesículas glutamatérgica. Depois de lavar o excesso de corante afastado por cerca de 30 minutos, as células estão prontos para ser pinçada e correção representados simultaneamente com um laser nm 488. A solução da pipeta patch contém um peptídeo rodamina-base que se liga seletivamente ao olho de lombo sináptica fita de proteína<sup> 4</sup>, Assim, a rotulagem fitas especificamente quando os terminais são gravadas com um laser nm 561. Isso permite que a localização precisa das zonas de ativos e da separação dos sináptica de extra-sináptica eventos.
Protocol
Discussion
As vantagens do objectivo do tipo de microscopia TIRF são que 1) ele fornece seccionamento óptico excelente restringindo luz de excitação a uma estreita região dentro do plano focal da objetiva, minimizando assim o fora-de-foco de luz, 2) já que a luz cai exponencialmente com a distância , o movimento em uma direção vertical pode ser monitorado como uma mudança na intensidade de fluorescência, 3) a coleta de luz eficiente através do objectivo de alta abertura numérica 1,5.
A principal desvantagem da técnica …
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant EY 14.990.
Referências
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- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
