全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス
Summary
このビデオでは、我々は内部全反射蛍光（全反射）顕微鏡を使用して金魚網膜双極細胞における単一シナプス小胞のエキソサイトーシスと人身売買にラベルを付けたり、視覚化する方法を示しています。
Abstract
全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、ガラスなどの高屈折率物質に最も近い蛍光分子の選択的なイメージングによって、細胞膜で発生するイベントの調査を可能にする技術です。<sup> 1</sup>。この記事では、金魚の網膜から単離された網膜双極細胞におけるシナプス小胞の画像のエキソサイトーシスにこの手法を適用する。これらのニューロンは、彼らの大きな軸索末端に起因するこの種の研究に非常に適している。双極細胞のクランプを同時にパッチすることで、それはシナプス前電圧とシナプス放出との関係を調査することが可能です。<sup> 2,3</sup>。双極細胞の端末内のシナプス小胞は、共同パフ色素と高Kを含むリンゲル液によって蛍光染料（FM 1から43 ®）を使用してロードされます<sup> +</supシナプス端子へ>濃度。これは、細胞を脱分極し、グルタミン酸作動性小胞へのエンドサイトーシスとそれに伴う色素の取り込みを刺激する。約30分間離れて余分な色素を洗浄後、細胞はパッチがクランプと488 nmのレーザーで同時に撮像されるための準備が整いました。パッチピペット溶液は、シナプスリボンのタンパク質のリブアイに選択的に結合するローダミンベースのペプチドが含まれています<sup> 4</sup>、端末が561 nmのレーザーで撮像する場合、それによって具体的にリボンにラベルを付ける。これは、アクティブなゾーンの正確な局在と余分なシナプスのイベントからシナプスを分離することができます。
Protocol
Discussion
客観型全反射顕微鏡の利点は、1）それはそれによって焦点のずれた光を最小限に抑え、目的の焦点面内に狭い領域に励起光を制限することにより、優れた光学セクショニングを提供することであり、2）光が距離と共に指数関数的に低下するので、 、垂直方向の移動は、蛍光強度の変化としてモニターすることができる、高開口数の対物1,5〜3）効率的な集光。
技法の主な欠点は、それが電子?…
Acknowledgements
この作品は、NIHのグラントEY 14990によってサポートされていました。
Referências
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
