Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Summary

En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.

Abstract

Total de reflexión interna de fluorescencia (TIRF) microscopía es una técnica que permite el estudio de los acontecimientos que suceden en la membrana celular, por la imagen selectiva de moléculas fluorescentes que están más cerca de una sustancia alto índice de refracción, como el vidrio¹. En este artículo, se aplica esta técnica a la exocitosis la imagen de las vesículas sinápticas en la retina las células bipolares aislados de la retina peces de colores. Estas neuronas son muy adecuados para este tipo de estudios debido a sus grandes terminales de los axones. Al mismo tiempo patch clamp las células bipolares, es posible investigar la relación entre la pre-sináptica de tensión y liberación sináptica^2,3. Las vesículas sinápticas dentro de las terminales de células bipolares se cargan con un tinte fluorescente (FM 1-43 ®) por la co-fumando el tinte y una solución de Ringer que contiene un alto K⁺ Concentración en los terminales sinápticos. Esto despolariza las células y estimula la absorción de colorante endocitosis y consecuente en las vesículas glutamatérgicas. Después de lavar el exceso de tinte de distancia de alrededor de 30 minutos, las células están listas para ser sujeta de parches y la imagen al mismo tiempo con un láser de 488 nm. La solución de la pipeta parche contiene un péptido rodamina basado en que se une selectivamente a la cinta RIBEYE proteína sináptica⁴, Con lo que el etiquetado cintas específicamente cuando los terminales son imágenes con un láser de 561 nm. Esto permite la localización precisa de las zonas activas y la separación de sináptica de extra-sináptica eventos.

Protocol

Parte 1: La disección y aislamiento de células bipolares Preparar las soluciones en la Tabla 2, el pH de timbres "(externo) de soluciones debe ajustarse a 7,4 con NaOH y el pH de la solución interna debe ser ajustado a 7,2 con CsOH. Proteja la solución interna de la luz con papel de aluminio y conservar a 4 ° C hasta su uso; Dark-un pez de colores para adaptarse al menos 30 minutos antes de la disección; Mientras que el animal se adapta oscuro, preparar 5 ml de la hialuronidasa …

Discussion

Las ventajas de los objetivos de tipo de microscopía TIRF son: 1) que proporciona seccionamiento óptico excelente mediante la restricción de la luz de excitación a una región estrecha en el plano focal del objetivo, minimizando de esta manera fuera del foco de luz, 2) ya que la luz disminuye exponencialmente con la distancia , el movimiento en sentido vertical se puede controlar con un cambio en la intensidad de la fluorescencia, 3) la colección de bajo consumo a través del objetivo de gran apertura numérica ^{de 1,5.}

<…