Cultura primária de Miócitos Coração Adulto Rat

Summary

Neste artigo, descrevemos uma forma típica para isolar e cultura miócitos adulto coração de rato. Colagenase e protease são usadas para digerir e isolar miócitos único. Miócitos cultivadas seguir este protocolo de responder às necessidades mais experiência.

Abstract

Cultura primária adulto células do coração de roedores são um sistema modelo importante para a pesquisa cardiovascular. No entanto, o estabelecimento de robusta, viável miócitos adulto culto pode ser um desafio técnico, passo limitante para muitos pesquisadores. Aqui nós descrevemos um protocolo para obter um alto rendimento de miócitos de ratos adultos coração que permanecem viáveis ​​em cultura por vários dias. O coração é isolado e perfundido com colagenase e protease em Ca baixo^{2 +} Condições para recuperar miócitos único. Ca^{2 +} Tolerante células são obtidas por um aumento gradual no Ca extracelular^{2 +} Concentração em três etapas de lavagem subseqüente. Células são filtrados, ressuspenso em meio de cultura, e banhado em deslizamentos laminina revestido. Miócitos cultivadas obtidos utilizando este protocolo são viáveis ​​por até quatro dias e são adequados para a maioria dos experimentos, incluindo eletrofisiologia, bioquímica, biologia molecular e de imagem.

Protocol

Preparação para a cirurgia Parte I. O dia antes da cirurgia de ratos, a certeza de que todas as soluções são feitas, mas não adicione nenhum enzimas ainda. Buffers A, B e do tampão de lavagem deve ser filtrado para todas as esterilidade antes do armazenamento. Os buffers devem ser todos armazenados a 4 ° C. 6-bem placas de cultura de tecido deve ser revestida com 10-20 mcg / mL laminina em 2 mL 1XSFM no dia anterior, bem como, e deve ser armazenado a 37 ° C em uma incubadora de C…

Discussion

Um passo crítico é a velocidade com que o coração isolado é preso no sistema de perfusão. A duração do período de digestão enzimática pode ser um pouco diferente para cada rato. O ajuste depende de como o coração se torna macia após o período regular de digestão. A recuperação lenta de Ca ^{2 +} após digestão enzimática é essencial para a obtenção de Ca ^{2 +} tolerante células saudáveis.

Para cobaia, o protocolo é o mesmo, exceto hialuronidase é u…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
NaCl		Sigma	S6191
KCl		Sigma	P9541
HEPES		Sigma	H4034
K2HPO4		Sigma	P9666
MgSO4		Fluka	63068
Glucose		Sigma	G7021
CaCl2		Sigma	C7902
Heparin Sodium Salt		Sigma	H4784
Collagenase Type II		Worthington Biochemical	LS004176
Protease XIV		Sigma	P5147
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)		Sigma	B0753
Carnitine		Sigma	C9500
Taurine		Sigma	T0625
Glutamic Acid		Sigma	G1501
BSA		Sigma	A3294
Creatine		Sigma	C3630
Antibiotic		Cellgro	30-009-CI
Media 199		GIBCO	11150
FBS		Hyclone	SH30071.03
Laminin		BD Bioscience	354232
water bath		Fisher Scientific	15-462-5
variable flow chemical pump		Fisher Scientific	15-077-67
6-well culture plate		Corning	3516