個別散在セルの優位を持つ細胞診標本からのセルブロックの準備

Summary

個々に散在する細胞と小細胞群を含む細胞診標本からAV -マーカー付きセルブロックの調製のためのShidhamの方法。

Abstract

このビデオでは、個々に散在する細胞と小細胞群を含む液体ベースのcervicovaginal細胞診標本からのセルブロックの調製のためのShidhamの方法を示しています。この手法は、従来の実験装置でHistoGel（サーモサイエンティフィック）を使用しています。

セルブロックのセクションの使用は非婦人科細胞診の評価のための貴重な補助的なツールです。彼らは、細胞病理学者が病変のアーキテクチャを含む、追加の形態学的試料の詳細を調べることができます。最も重要なことは、彼らは、in situハイブリダイゼーション試験（FISH / CISH）とのin – situポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、このような免疫細胞化学などの補助的な研究の評価が可能になります。従来のセルブロックの調製技術は、主に体液の滲出液および穿刺吸引生検のために一般的に、非婦人科細胞診標本に適用されている。

液体ベースのcervicovaginal標本は多くの個々の散在のセルとの非婦人科比べ相対的に小さい携帯電話です。このため、セルブロックのセクション内に十分な細胞数は達成することは困難である。さらに、ブロックの切削histotechnologistは、細胞が最も高い濃度にさらされているレベルを可視化することはできません。したがって、セクションは、テスト用スライドガラスに転送するように選択されることができる適切なレベルを監視するのは困難です。その結果、目的の細胞と細胞のブロックの面積はどちら過去切断または十分深くカットしないことで、見逃されることがある。 Shidhamのメソッドの現在のプロトコルは、これらの問題に対処します。このプロトコルは、婦人科、液体ベースの細胞診標本のための標準化と報告ですが、それはまた、滲出液、FNA、ブラッシング、セルブロックのセクションの診断材料の品質向上のための嚢胞の内容などのような非婦人科標本に適用することができます。

Protocol

はじめに： これはHistoGelTM（サーモサイエンティフィック）（HG）を使用して液体ベースの細胞診（LBC）標本からのセルブロックの準備のためのShidhamの方法を説明するビデオです。他のランダムなアプローチと比較して、以下は単独で散在バラセル（1-5）と比較的hypocellular標本から細胞のブロックを製造するためのこのプロトコルの2つの重要な機能です。 このプロトコルは、セルのブロックの切断面に平行な平面に沿って細胞を濃縮するための手順が含まれます。 また、以下の目的のうちの2つを提供するAV -マーカー（図1b）、のビーコンのようなダークインクルージョンが含まれています。 細胞が濃縮されるレベルを可視化へ。暗い色のビーコンが切削中にさらされているときに目的の細胞と細胞のブロックの面積は現在histotechnologistによって可視化することができます。監視するには、この能力は、細胞の大部分でレベルを切断、またはサンプルの細胞の最も高い濃度でのレベルにあまりにも表面的なカットではないのを妨げる。 別のスライド上でシリアルセルブロックのセクションのロケータの基準点として機能する。この基準点は、SCIPのアプローチ（6,7）と座標の免疫反応性のパターンの評価のための細胞の特定の細胞またはグループを検索するためのビーコンとして機能します。 PROTOCOL（図2） サンプルの調製。 平底ガラス管（直径15mmさx 45mm）（2.4〜図2.1）に残留LBC子宮頸部細胞診標本を転送する。大きなプラスチック製のキャリアのチューブ（28 × 85ミリメートル）と遠心分離機にガラス管を置きます。キャリアのチューブからガラス底のチューブを外し、上清を取り除き。 ガラス管は、蓋を（次のステップで加熱水の流出を防止するため）と大きな平底のキャリアのプラスチックチューブの内側に戻されるガラス管を含むキャリアのプラスチック製のチューブは、その後、ふたを遠心分離機に入れ（ 細胞がガラス管の平らな底に垂直に落ちるように旋回カップではなく、固定アングルカップ付き ）、および1805でG（3000 rpmをスピンしているローター半径- 17センチメートル）5分（図2.5）のため。 試験管を遠心分離器から垂直に削除され、小さなガラス管は、細胞を沈殿ペレットを乱すことなく、より大きなキャリアのプラスチックチューブから鉗子で除去する。 試験片とガラス管が非キャップされ、上清は下部の堆積物の細胞の平らな層（図2.6）を乱さないように注意しながらオフ注がれています。 基準座標AV -マーカーの包含およびゲルの追加暗いビーコンAV -マーカー （2 × 2mmの大きさについて、フラットは、暗い色、sectionable材料の断片を表面化）（図3）ガラス管（図2.7）への道標として追加されます。 ミディアムパワーで10秒間電子レンジで溶かしてHGのアリコートを液化する。 、チューブに溶融HGの0.5 mlを加え素早く堆積物と混合し、（図2.8）、それを要約（HGが凝固を開始できるようにすることなく、迅速に次のステップに進みます）。 キャリアのプラスチックチューブに温かい（45℃）水（図2.9）の約2.5 mlを追加します。 小さなキャップガラス管は、暖かい水とプラスチック製のチューブ内に配置されます。 （この手順は、次のステップの間に固化するからHGを維持する必要がある）（図2.9）。 キャリアのプラスチック製のチューブは、（ 細胞がガラス管の平らな底に垂直に落ちるように旋回カップと固定されていない角のカップ付き ）遠心分離機に入れ、と5のための1805 G（3000 rpmの、ローター半径- 17センチメートル）で回転さ分。この遠心分離のステップの目的は、AV -マーカーをプッシュすると近い最後のパラフィン包埋細胞のブロック（図1d）の切断面の層に細胞を集中することです。 チューブを下部に、サンプルの細胞と沈殿した薄い層を乱さないように注意しながら遠心機から静かにして垂直に削除されます。 大きなプラスチック製のチューブは非キャップされており、小さいガラス管は、試料の細胞の堆積層を乱すことなく、ピンセットで垂直に削除されます。 小さなガラス管は、HG（図2.11）を冷却固化するために15分間垂直位置で冷凍です。 最終処理のための試料を用いてゲルのボタンなど、セルブロックの除去下部に集中/堆積物試料の層を持つ固化HGディスクは、注射器（図2.12）と23ゲージの針を通して10％ホルマリンを潮吹きで平坦な底部のガラス管から外れている。 針は、試料（図2.12）と固化HGディスクの周辺部での管の側面に沿って挿入されます。 needlホルマリンがゆっくりとシリンジを介してプッシュされる一方、電子は管の側面に沿って回転される。暗い色のビーコンAV -マーカーとガラス管の平底（図2.12）からそれに集中標本とともにHGボタンの分離でこの結果。 セルブロック（試料の細胞とゲルのボタン）は、標識カセット内に配置し、パラフィン包埋セルブロック（図2.13）を調製するために組織の処理のために送信されます。 埋め込みと試料の切断ディスクは切断面のようなダウン暗いビーコンマーカー側（図1）とパラフィンに埋め込まれています。 ビーコンなどの暗い色のAV -マーカーが露出し、はっきりと見えるようになるまでブロックは切片です。 3〜4ミクロンの切片を試料から単独で散在する細胞のほとんどが含まれている必要がありますこのレベルからカットされています。 セクションは、さらに染色、免疫組織化学染色、または示されるように他のテスト用のガラススライド上に収集されます。セクションをマウントするために使用するスライドの種類を含めこれらのテストのためのプロトコルが異なる場合があります。一般的に免疫染色のために、コーティングされたスライドは、免疫染色のステップ中に浮遊し、スライドからセクションの損失を防ぐために使用されます。 （アルファベット順）使用される略語：CISH、in situハイブリダイゼーション試験発色、FISH、蛍光in situハイブリダイゼーション試験、FFPE、ホルマリン固定パラフィン包埋、FNA、穿刺吸引、HG、HistoGel™（サーモサイエンティフィック）; LBC、液体ベースの細胞診、PCRのポリメラーゼ連鎖反応; 図1。Shidhamのプロトコルによって調製された細胞のブロックの構造。 図2。ShidhamのプロトコルによってLBC検体からのセルブロックを調製するためのさまざまな手順の概要。 図3。バナナの皮からAV -マーカーの調製。 図4とし、AV -マーカーなしのセルブロックとセクションの比較。 図5。AV -マーカーがある場合とない場合のセルのブロックのセクションの細胞数の比較。

Discussion

セルブロックは、様々な細胞診標本（1）の評価のための貴重なツールです。最も重要なことは、試料のアーキテクチャの詳細に加えて、セルのブロックは、免疫細胞化学などの補助的な研究は、発色/蛍光in – situハイブリダイゼーション試験（FISH / CISH）とのin – situ PCRの評価を可能にする。セルブロックの調製のための様々な方法が記載されている。しかし、これらのほとんどは、比較的多くの細胞を含む、組織のFNA吸引のようなmicrofragmentsや滲出液（1,3,4,5）などのいくつかの漿液性の液体で、非婦人科細胞診標本に適しています。

セルブロックは、主に免疫細胞化学的評価のための機会を提供するので、それらの処理は、好ましくは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織のそれのようになります。最終的にセルブロックのセクションの免疫細胞化学的評価後に得られた結果は、FFPE組織切片で主に行わ発表された文献とのそれらと比較されます。プロトコル内の任意の変化は、潜在的にルーチンFFPEのために使用される以外のさまざまな固定液と試薬のシーケンスを通じて処理セルブロックで得られた結果の妥当性が損なわれ、無効にする。いくつかの商用技術は他の固定液、試薬の露出への曝露のプロトコルを介して処理の欠点を持つことができます。

セルブロックの準備の様々な方法は、堆積物および組織断片のかなりの量の試料のために用意されています。主に、濃縮された堆積物は、いくつかのゲルまたは凝集の原理によってサポートされています。操作しやすいボタンは、外科病理標本/生検のように処理した後、パラフィンに埋め込まれています。

使用するゲルは、ゼラチン、寒天、フィブリノーゲン/プラズマトロンビン、およびそのようなHGのような他の市販のゲルを含む。濃度のメソッドは、遠心分離によって沈殿物の単純なペレットからの膜の様々なタイプに沿って細胞の濃度に変化する。例としては：ミリポア、collodin（Celloidin）バッグまたはガラススライド（1）細胞診塗抹標本から細胞をこすりを。我々はまた、寒天とゼラチンの様々な組み合わせを試すことによってゲルの多様性を評価した。組み合わせのどれもワンピースの試料から埋め込まれた細胞と凝固ゲルの簡単に操作しやすいディスクを入手するために会社に十分な一貫性を達成していない。 HGは、適切な一貫性を示し、我々の経験でHGのセルブロックのセクションでの免疫染色の結果が優れている。

前述のようにcervicovaginal細胞診のための液体ベースの細胞診（LBC）標本は、一般的に非婦人科標本よりも携帯電話です。さらに、婦人科LBC標本は主にcervicovaginal粘膜から個々の散在剥離した表層の細胞が含まれています。このため、セルブロックのセクション内の適切な細胞充実性は、特別なアプローチなしでは達成されないことがあります。ブロックはセクションカット時のhistotechnologistが見ることができないで、これらの単独で散在する細胞成分として、細胞がセクションに表示されて開始されるレベルは高く評価することはできず、どちらかほとんどの細胞でレベルを越えてカットしてかどうか、見逃されることがあるサンプルセルの最高濃度（図4）でレベルに十分に深くカット。 Shidhamのプロトコルは、培地と従来のラボ機器（2）（図2）を埋め込むようにHGを使用して、これらの問題の両方に対応しています。

このプロトコルは、2つの主な機能（図1）以下が含まれます。

1. 隣接およびセルブロック（図5）の切断面に平行な狭い面で単独で散在して細胞の濃度と整列。
2. 道標としてビーコンのような暗いAV -マーカーの包含。これは、次の機能を得るために重要です。
   1. 識別し、細胞をセルブロックに集中してレベルを監視すること。 濃い色の道標の暴露は、セルブロックで単独で散在して細胞のほとんどが （図4）が配置されると予想されるレベルを強調しています。これによセルブロックへの伐採 （ほとんどの細胞でレベルを越えて切断）やアンダーカット （サンプルセルの最高濃度でレベルに十分深くカットされていない）と最高濃度に対応するセルブロックのレベルからのセクションの選択を可能に細胞の。
   2. セクションで暗い色の道標にも別のスライド上のセルのブロック（図4）の別の連続切片で全く同じ細胞を調査し、識別するための基準点として機能します。別のセクション（6,7）で同じセルに従うようにSCIPのアプローチにより、特定のセルの座標プロパティなどimmunoprofileを解釈し、評価しながら、これは非常に重要です。

OUもののRプロトコルは、液体ベースの子宮頸部細胞診標本のための標準化と報告されている、それはまた、さらにAVマーカーを改善促進するような滲出液、FNA、ブラッシング、嚢胞の内容等、多くの他の非婦人科標本の診断率を高めるために使用することができますこれらの標本のセルブロックの切片の免疫組織化学評価中にSCIPのアプローチの応用。埋媒体は、関連するステップで適切な変更を加えて他の試薬に置き換えてもよい。 HGは、室温（1）においてトロンビンによってゲル化するプラズマ（フィブリノーゲン）に置き換えてもよい。