Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Summary

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Abstract

In de klassieke eiwitkleuring protocollen met behulp van Coomassie Brilliant Blue (CBB), oplossingen met een hoog gehalte aan giftige en brandbare organische oplosmiddelen (methanol, ethanol of 2-propanol) en azijnzuur worden gebruikt voor fixatie, kleuren en ontkleuren van eiwitten in een gel na SDS -PAGE. Het versnellen van de procedure, het verwarmen van de kleuroplossing in de magnetron voor een korte tijd wordt vaak gebruikt. Dit resulteert meestal in verdamping van giftige of gevaarlijke methanol, ethanol of 2-propanol en een sterke geur van azijnzuur in het lab die moeten worden vermeden vanwege de veiligheid overwegingen. In een protocol oorspronkelijk gepubliceerd in twee octrooiaanvragen door EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), is een alternatieve samenstelling van de kleuroplossing beschreven waarin geen organische oplosmiddelen of zuur wordt gebruikt. Het CBB is opgelost in dubbelgedestilleerd water (60-80 mg van het CBB G-250 per liter) en 35 mM HCl wordt toegevoegd als de enige andere verbinding in de kleuroplossing. Het CBB staning van de gel gebeurt na SDS-PAGE en grondig wassen van de gel in dubbelgedestilleerd water. Door het verwarmen van de gel tijdens het wassen en vlekken stappen, kan het proces sneller worden afgewerkt en er geen giftige of gevaarlijke compunds worden verdampen. De kleuring van eiwitten gebeurt al binnen 1 minuut na het verwarmen van de gel in kleuroplossing en is volledig ontwikkeld na 15-30 minuten met een licht blauwe achtergrond die volledig ontkleurd bij langdurige wassen van de gekleurde gel in dubbelgedestilleerd water, zonder dat de lood-eiwit bands.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding van de CBB kleuroplossing 60-80 mg van het CBB G-250 worden opgelost in 1 liter dubbelgedestilleerd water door roeren gedurende 2-4 uur. Tot slot, is 3 ml geconcentreerd HCl toegevoegd aan de donkerblauwe oplossing onder roeren nog een minuut en in het donker bewaard voor later gebruik. De oplossing kan worden opgeslagen voor weken tot enkele maanden zonder verlies van de vlekken efficiëntie. Geconcentreerde HCl moeten worden behandeld met de gebruikelijke zorg und gebruikt on…

Discussion

• Het wassen stappen zijn cruciaal voor de efficiënte kleuren van de eiwitten. Een verminderde wastijd minder dan 2 min of verminderd volume van het water (<50 ml) kan resulteren in een lichtblauw eiwitbanden, waarschijnlijk als gevolg van hogere hoeveelheden van de resterende SDS in de gel.
• Als de eiwitten zullen worden geanalyseerd door massaspectrometrie, de verwarming stappen in de magnetron moet worden overgeslagen, is de tijd voor het wassen van de gel uitgebreid tot ongeveer 10 min in elke stap en de kleuring tijd ve…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Coomassie Brilliant Blue G-250		AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl