In questo video vi presentiamo il<em> Ex vivo</em> Generazione ed espansione dei diritti umani CD40 delle cellule B attivate (CD40-B) dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) attraverso la stimolazione con il ligando CD40 e l'interleuchina-4.
CD40-attivate le cellule B (linfociti B CD40-) sono stati identificati come fonte alternativa di immuno-stimolatorie cellule presentanti l'antigene (APC) per l'immunoterapia del cancro 1-3. Rispetto alle cellule dendritiche (DC), il miglior APC caratterizzato, le cellule CD40-B hanno diverse proprietà distinte biologici e tecnici. Simile alla DC, le cellule B mostrano un aumento dell'espressione di MHC e molecole co-stimolatorie (Fig.1b), mostrano una forte capacità migratoria e presentazione dell'antigene presente in modo efficiente alle cellule T, dopo stimolazione con il ligando dell'interleuchina-4 e CD40 (CD40L). Tuttavia, a differenza di DC immature o mature, le cellule B CD40-esprimono la piena triade nodo homing linfa composto da CD62L, CCR7/CXCR4, e la funzione dei leucociti antigene-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessaria per homing di organi linfatici secondari (Fig.1a) 3. Cellule CD40-B può essere generato senza difficoltà da piccolissime quantità di sangue periferico che può essere ulteriormente espanse in vitro di grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (> 10 9 cellule per paziente) da donatori sani e come il cancro pazienti (Fig.1c, d) 1,4.
In questo protocollo dimostriamo come ottenere pienamente attivato le cellule B CD40-da PBMC umane. Molecole chiave per la coltura cellulare sono ligando CD40, l'interleuchina-4 (IL-4) e ciclosporina A (CsA), che viene rifornito in un ciclo di 3-4 cultura giorno. Per scopi di laboratorio CD40-stimolazione è fornito da NIH/3T3 cellule che esprimono CD40 ligando ricombinante umano (tCD40L NIH/3T3) 5. Per evitare la contaminazione con le cellule non transfettate, espressione del ligando CD40 umano sulla trasfettate deve essere controllata regolarmente (Fig.2).
Dopo 14 giorni CD40-B colture cellulari costituiti da oltre il 95% delle cellule B puro e una espansione del CD40 delle cellule B con più di 65 giorni è spesso possibile senza alcuna perdita di funzione 1, 4. Le cellule B CD40-in modo efficiente raccogliere, trasformare e antigeni presenti alle cellule T 6. Non solo naϊve primo, ma anche di espandere le cellule T di memoria 7,8. CD40-attivate le cellule B possono essere utilizzati per studiare l'attivazione delle cellule B, la differenziazione e la funzione. Inoltre, essi rappresentano uno strumento promettente per la vaccinazione terapeutica o preventiva contro i tumori 9.
A. Preparation of Media:
Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
DMEM-Ham’s / F12 | DMEM-Ham’s / F12 | ||
L-Glutamine | 365 μg/mL | L-Glutamine | 365 μg/mL |
FBS | 10 % | FBS | 10 % |
HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
G-418 | 0.7 mg/mL |
CD40-B washing medium | CD40-B culture medium | ||
Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
IMDM | |
IMDM | |
L-Glutamine | 584 μg/mL | L-Glutamine | 584 μg/mL |
HEPES | 25 mM | HEPES | 25 mM |
Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
rh Transferrin | 50 μg/mL | ||
rh Insulin | 5 μg/mL | ||
AB-Humanserum | 10 % |
B. Miscellaneous Reagents:
Reagent | Company | Order No |
DMEM / Ham’s F12 | PAA | Cat No: E15-813 |
IMDM | Invitrogen Gibco® | REF 21980-032 |
Dulbecco’s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 |
holo-Transferrin human | Sigma | Cat No T0665 |
Insulin human | Sigma | Cat No I2643 |
Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 |
Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
G-418 Sulphate | PAA | Cat No P02-012 |
Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
Reagent | Company | Order No |
Sterile pipette tips | Sarstedt | |
6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
Tissue culture flask | SARSTEDT | Cat No 83.1813.002 |