Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikroinjektion und hochauflösende Bildgebung in der<em> Drosophila melanogaster</em> Syncytial Embryo Mitose studieren.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des Drosophila melanogaster-Syncytial-Embryo für das Studium der Mitose 1. Drosophila hat nützliche Genetik mit einem sequenzierten Genoms, und es kann leicht zu pflegen und manipuliert werden. Viele mitotischen Mutanten existieren, und transgenen Fliegen zum Ausdruck funktionaler fluoreszierend (zB GFP) – getaggt mitotischen Proteine wurden und werden generiert. Gezielte Genexpression ist möglich mit dem GAL4/UAS System 2.
Die Drosophila frühen Embryo führt mehrere Mitosen sehr schnell (Zellzyklus Dauer ≈ 10 min). Es ist gut für die Bildgebung der Mitose geeignet, da während der Zyklen 10-13, Kerne teilen sich rasch und synchron ohne einzugreifen Zytokinese an der Oberfläche des Embryos in einem einzigen Monoschicht knapp unterhalb der Hirnrinde. Diese sich schnell teilenden Kerne wahrscheinlich die gleichen mitotischen Maschinen wie andere Zellen, aber sie sind auf Geschwindigkeit optimiert; Kontrollpunkt wird allgemein angenommen, um nicht stringent, so dass das Studium der mitotischen Proteine, deren Fehlen würde Zellzyklusarrest in Zellen mit einem starken Checkpoint Ursache . Embryonen, die GFP-markierten Proteinen oder mikroinjiziert mit fluoreszenzmarkierten Proteine können leicht abgebildet werden, um Live-Dynamik (Abb. 1) zu folgen. Darüber hinaus können Embryonen mit Funktions-blockierende Antikörper oder Inhibitoren von spezifischen Proteinen, um den Effekt des Verlustes oder der Störung ihrer Funktion 3-Studie mikroinjiziert werden. Diese Reagenzien können in den Embryo diffuse und erreichte viele Spindeln zu einem Gradienten der Konzentration des Inhibitors, was wiederum in einer Steigung von Mängeln vergleichbar mit einer allelischen Serie von Mutanten. Produzieren Im Idealfall, wenn das Zielprotein fluoreszierend markiert ist, kann die Steigung der Hemmung direkt dargestellt werden 4. Es wird davon ausgegangen, dass die stärksten Phänotyp vergleichbar mit der null-Phänotyp ist, obwohl es schwer ist, formal die Möglichkeit ausschließen, dass die Antikörper können dominanten Effekte in seltenen Fällen so strenge Kontrollen und eine vorsichtige Interpretation haben muss angewendet werden. Weiter entfernt von der Injektionsstelle ist Protein Funktion nur teilweise verloren damit andere Funktionen des Zielproteins sichtbar zu machen.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll ist relativ einfach, aber jeder Schritt der Praxis erfordert, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht beschädigt werden. Sorgfältige Kontrolle Experimente brauchen immer zu tun, um sicherzustellen, dass zuverlässige Ergebnisse zu erhalten werden. Ein guter Weg, dies zu beginnen, ist durch Mikroinjektion Puffer oder Rhodamin Tubulin zu kontrollieren Embryonen, die GFP-Tubulin, um sicherzustellen, dass die Mitose in der Regel durchläuft alle Zyklen bei dem Embryo Oberfläche (Zyklen 10 bis 13). I…
Acknowledgements
Dieses Protokoll wird derzeit in unserem Labor eingesetzt und hat im Laufe der Jahre von vielen Menschen, darunter Dr. David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur verfeinert. Wir danken Dr. Bill Sullivan (UCSC), die uns mit ausgezeichneten Beratung auf die Manipulation und Mikroinjektion der frühen Drosophila-Embryonen, wenn unsere Arbeit in diesem System, das initiiert wurde (Code 13). Wir danken allen Mitgliedern des Scholey Labor. Unsere Arbeit auf die Mitose in Drosophila wird durch NIH GM55507 unterstützt.
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