大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造
Summary
季節低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体から分離された環境ゲノムDNAとのフォスミドライブラリーの構築が記載されている。得られたクローンのライブラリーは384ウェルプレートに取り、自動コロニーピッキングシステムのアプリケーションによって下流の塩基配列決定と機能的スクリーニングのためにアーカイブされます。
Abstract
自然界における微生物の大半は現在、従来の栽培方法にアクセスできないままです。過去10年間、カルチャに依存しない環境ゲノム（<em>すなわち</em>メタゲノム）アプローチは、研究者は環境から直接土着微生物群集の遺伝的内容をキャプチャすることで、この栽培のギャップを埋めることが可能に、浮上している。この目的のために、ゲノムDNAライブラリーは、巧みな実験室のクローニング技術とはいえ、標準を使用して構築されています。ここでは、季節的低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体に由来するDNAで大規模な挿入、環境ゲノムフォスミドライブラリーの構築について説明します。このプロトコルは直接沿岸海洋の水の採取[1]などの接続プロトコルのシリーズにリンクされている微生物バイオマスの、大量のろ過[2]とDNA抽出と浄化のプロトコル[3]。当初は、高品質のゲノムDNAは、5 – リン酸化平滑末端の作成を終了 – 修理です。エンド修理DNAは、サイズの選択とゲル抽出を30と6万塩基対（KB）の長さの間のDNA断片を回収するために行われるため、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を施す。サイズ選択されたDNAをPFGEゲルマトリックスから精製し、ホスファターゼ処理、平滑末端フォスミドCopyControlベクトルPCC1（EPICENTREに連結され<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>）。 PCC1とインサートDNAのリニアコンカテマーは、その後、ファージ耐性のその後の感染症で、ラムダterminaseによってファージ粒子にパッケージheadfullされています<em> E.大腸菌</em>細胞。成功した形質導入クローンを抗生物質選択の下にLB寒天プレートに回収し、ロボットがピッキング、自動コロニー（Qpix2、GENETIX）を用いて384ウェルプレートフォーマットでアーカイブされます。現在のプロトコルは、（4）〜（7）をEPICENTREからCopyControlフォスミドライブラリーの制作キットを含むさまざまなソースから描画し、複数の研究グループの出版された作品。各ステップは心のベストプラクティスが提示されます。可能な限り我々はライブラリの生産の全体的な品質と効率を向上させるために実行に微妙な点を強調。フォスミドライブラリーの製造と自動コロニーピッキングのプロセス全体が含まれている多くのインキュベーションのステップがあるとして、少なくとも7〜10日かかる。しかし、プロトコル内で言及されている可能性がいくつかの停止ポイントがあります。
Protocol
Discussion
手順は、最も効率的に沿岸水のサンプルに由来するゲノムDNAを持つ大規模挿入フォスミドライブラリを生成する方法を説明しています。アップストリームゲノムDNAの抽出は、別々のプロトコル[3]に記述されています。
フォスミドライブラリとしての生産は、すべての4つ表示される手順を含む、全体の手続きに間に合うように多段階のプロセス、計画は少なくとも2〜3週?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTとSLは、微生物の多様性と進化（CMDE）用トゥーラ基礎資金センターからの奨学金によってサポートされていました。 MTはまた、ドイツ学術振興協会（DFG）から奨学金の支援を受けた。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
Referências
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
