مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج
Summary
يوصف بناء مكتبة fosmid مع الحمض النووي الجيني البيئية معزولة عن عمق التواصل الرأسي لالمضيق البحري ميتة موسميا. يتم اختيار مكتبة استنساخ الناتج إلى 384 لوحات وكذلك المحفوظة في التسلسل الوظيفي المصب والفرز من تطبيق نظام اختيار مستعمرة الآلي.
Abstract
الغالبية العظمى من الميكروبات في الطبيعة تبقى غير قابلة للوصول في الوقت الراهن لأساليب الزراعة التقليدية. على مدى العقد الماضي ، والثقافة المستقلة الجينومية البيئية (<em> أي</emبرزت> metagenomic) النهج ، وتمكين الباحثين من سد هذه الفجوة من خلال زراعة التقاط المحتوى الجيني للمجتمعات الميكروبية الأصلية مباشرة من البيئة. ولهذه الغاية ، هي التي شيدت المكتبات الحمض النووي الجيني باستخدام معيار وإن كان داهية تقنيات الاستنساخ المختبر. نحن هنا وصف لبناء مكتبة كبيرة تضاف الجينومية البيئية fosmid مع الحمض النووي المستمدة من عمق التواصل الرأسي لالمضيق البحري ميتة موسميا. ويرتبط هذا البروتوكول مباشرة على سلسلة من البروتوكولات مرتبطة بما في ذلك أخذ عينات المياه الساحلية البحرية [1] ، والترشيح كمية كبيرة من الكتلة الحيوية الميكروبية [2] ، واستخراج الحمض النووي والبروتوكول تنقية [3]. في البداية ، وارتفاع الحمض النووي الجيني نوعية نهاية اصلاحها مع إنشاء 5 – فسفرته ينتهي حادة. يخضع نهاية إصلاح الحمض النووي لهلام إستشراد نابض الميدان (PFGE) لاختيار الحجم ويتم تنفيذ استخراج الهلام لاسترداد شظايا الحمض النووي بين 30 و 60 ألف زوج قاعدة (ك) في الطول. يتم تنقية الحمض النووي بعيدا عن تحديد حجم المصفوفة هلام PFGE وligated لمعاملة فظة الفوسفاتيز نهاية fosmid pCC1 ناقلات CopyControl (EPICENTRE<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> http://www.epibio.com/item.asp؟ID=385</a>). concatemers pCC1 خطية من والدنا وتضاف لاحقا headfull حزم جسيمات في فج من قبل terminase امدا ، مع الإصابة اللاحقة مقاومة بالعاثية<em> E. القولونية</em> الخلايا. يتم استرداد استنساخ transduced بنجاح على لوحات أجار LB تحت اختيار المضادات الحيوية والمؤرشفة في 384 لوحة كذلك تنسيق باستخدام مستعمرة الروبوت الآلي قطف (Qpix2 ، GENETIX). البروتوكول الحالي يستمد من مصادر مختلفة بما في ذلك طقم Fosmid CopyControl إنتاج مكتبة من EPICENTRE والأعمال المنشورة للمجموعات بحثية متعددة [4-7]. يتم تقديم كل خطوة مع أفضل الممارسات في الاعتبار. كلما كان ذلك ممكنا نبرز الدقيقة في التنفيذ لتحسين الجودة الكلية وكفاءة الإنتاج المكتبة. كامل عملية الإنتاج الآلي والمكتبة fosmid اختيار مستعمرة يستغرق ما لا يقل عن 7-10 أيام وهناك خطوات عديدة شملت حضانة. ومع ذلك ، هناك العديد من نقاط التوقف المحتملة التي يتم المذكورة في البروتوكول.
Protocol
Discussion
ووصف الإجراء كيفية بأكبر قدر من الكفاءة إنشاء مكتبة واسعة مع إدراج fosmid الحمض النووي الجيني المستمدة من عينة المياه الساحلية. يوصف أعلى المصب استخراج الحمض النووي الجيني في بروتوكول منفصل [3].
حيث بلغ الإنتاج fosmid مكتبة هي متعددة ال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية وصندوق التنمية الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) من كندا لدعم الدراسات الجارية على المناطق المنخفضة من الأوكسجين مياه المحيطات والمناطق الساحلية المفتوحة. ودعمت طن متري والزمالات التي SL من مركز تولا مؤسسة ممولة للتنوع وتطور الميكروبية (CMDE). كما تلقى دعم MT الزمالة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
Referências
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
