Grote Plaats Milieu Genomic Library Production
Summary
Bouw van een fosmid bibliotheek met milieu-genomisch DNA geïsoleerd uit de verticale diepte continuüm van een seizoensgebonden hypoxische fjord is beschreven. De resulterende kloon bibliotheek is geplukt in de 384-wells platen en gearchiveerd voor downstream-sequencing en functionele screening door de toepassing van een geautomatiseerd kolonie picking systeem.
Abstract
De overgrote meerderheid van micro-organismen in de natuur op dit moment ontoegankelijk blijven voor de traditionele teeltmethoden. In het afgelopen decennium, de cultuur-onafhankelijke milieu-genoom (<em> Dat wil zeggen</em> Metagenomic) benaderingen naar voren zijn gekomen, zodat onderzoekers deze teelt kloof te overbruggen door het vastleggen van de genetische inhoud van de inheemse microbiële gemeenschappen direct uit de omgeving. Daartoe zijn genomische DNA-bibliotheken gebouwd met behulp van standaard-zij het kunstzinnige laboratorium kloontechnieken. Hier beschrijven we de bouw van een grote insert milieu genomische fosmid bibliotheek met DNA afgeleid van de verticale diepte continuüm van een seizoen hypoxische fjord. Dit protocol is direct gekoppeld aan een reeks van samenhangende protocollen waaronder kustgebieden zeewater bemonstering [1], grote hoeveelheden filtratie van microbiële biomassa [2] en een DNA-extractie en zuivering van het protocol [3]. In het begin, hoge kwaliteit genomisch DNA is end-gerepareerd met de creatie van 5-gefosforyleerd stompe uiteinden. End-DNA gerepareerd wordt onderworpen aan pulsed-field gel elektroforese (PFGE) voor grootte selectie en gel extractie wordt uitgevoerd om DNA-fragmenten te herstellen tussen de 30 en 60 duizend basenparen (Kb) in de lengte. Geselecteerde formaat DNA wordt gezuiverd uit de buurt van de PFGE gel matrix en geligeerd aan de fosfatase behandelde blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRUM<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Lineaire concatemers van pCC1 en steek DNA worden vervolgens headfull verpakt in faag deeltjes door lambda terminase, met de daaropvolgende infectie van faag-resistente<em> E. coli</em> Cellen. Succes getransduceerde klonen worden teruggewonnen op LB agar platen onder antibiotische selectie en gearchiveerd in 384-wells plaat formaat met behulp van een geautomatiseerd kolonie picking robot (Qpix2, GENETIX). Het huidige protocol put uit diverse bronnen, waaronder de CopyControl Fosmid Library Production Kit uit EPICENTRUM en de gepubliceerde werken van meerdere onderzoeksgroepen [4-7]. Elke stap wordt gepresenteerd met de beste praktijk in het achterhoofd. Waar mogelijk hebben we subtiliteiten in de uitvoering benadrukken om de algehele kwaliteit en efficiëntie van de bibliotheek te verbeteren. Het hele proces van fosmid bibliotheek productie en geautomatiseerde kolonie plukken duurt minstens 7-10 dagen, omdat er veel inbegrepen incubatie stappen. Echter, er zijn verschillende stopplaatsen mogelijk die worden vermeld in het protocol.
Protocol
Discussion
Een procedure wordt beschreven hoe u de meest efficiënte wijze een grote insert fosmid bibliotheek met genomisch DNA afgeleid uit een kust watermonster te genereren. Up-stream genomisch DNA-extractie wordt beschreven in een apart protocol [3].
Omdat de fosmid-bibliotheek is een productie van meerstaps-proces, plan minstens twee tot drie weken op tijd voor de hele procedure, inclusief alle vier gepresenteerde stappen. De winning van genomisch DNA is de meest cruciale stappen en alle down-str…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada te bedanken voor de ondersteuning van lopende studies op een laag zuurstofgehalte regio's van kust-en open water van de oceaan. MT en SL werden ondersteund door beurzen uit het TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie (CMDE). MT kreeg ook fellowship steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
Referências
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
