Stora Sätt Miljö Genomic Bibliotek Produktion
Summary
Byggandet av en fosmid bibliotek med miljö-genomisk DNA isolerat från det vertikala djup kontinuum av en säsongsmässigt hypoxisk fjord beskrivs. Den resulterande klon biblioteket läggs i 384-brunnars plattor och arkiveras för nedströms sekvensering och funktionell screening genom tillämpning av ett automatiserat koloni plocksystem.
Abstract
De allra flesta av mikrober i naturen förblir närvarande otillgänglig till traditionella odlingsmetoder. Under det senaste årtiondet, kultur-oberoende miljö-genomisk (<em> Dvs</em> Metagenomic) metoder har kommit fram, möjliggöra för forskare att överbrygga denna odling klyftan genom att fånga den genetiska innehåll inhemska mikrobiella samhällen direkt från omgivningen. För detta ändamål är genomisk DNA bibliotek konstrueras med hjälp av vanliga än konstnärlig laboratorieteknik kloning. Här beskriver vi byggandet av en stor in miljö-genomiska fosmid bibliotek med DNA från det vertikala djup kontinuum av en säsongsmässigt hypoxisk fjorden. Detta protokoll är direkt kopplat till ett antal anslutna protokoll inklusive kustnära marina vatten provtagning [1], stor volym filtrering av mikrobiell biomassa [2] och en DNA-extraktion och rening protokoll [3]. I början är hög kvalitet arvsmassans DNA slutet repareras med skapandet av 5-fosforylerade trubbiga ändar. Slutet reparerade DNA utsätts för pulsade fält gelelektrofores (PFGE) för storlek urval och gel extraktion utförs för att återvinna DNA-fragment mellan 30 och 60 tusen baspar (KB) i längd. Storlek utvalda DNA renas bort från PFGE gelmatrisen och knyts ihop till fosfatas-behandlade trubbig slut fosmid CopyControl vektor pCC1 (EPICENTRUM<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linjär concatemers av pCC1 och sätt DNA headfull därefter förpackas i fag partiklar med lambda terminase, med efterföljande infektion av fag-resistenta<em> E. coli</em> Celler. Framgångsrikt transduced kloner återvinns på tallrikar LB agar i antibiotika urval och arkiveras i 384-brunnars platta format med hjälp av ett automatiserat koloni plocka robot (Qpix2, GENETIX). Den nuvarande protokollet drar från olika källor, däribland CopyControl Fosmid biblioteket Produktion Kit från EPICENTRUM och publicerade verk av flera forskargrupper [4-7]. Varje steg visas med bästa praxis i åtanke. När det är möjligt att vi lyfta fram nyanser i utförande för att förbättra den övergripande kvaliteten och effektiviteten i bibliotekets produktion. Hela processen med fosmid bibliotek produktion och automatiserad koloni plocka tar minst 7-10 dagar eftersom det finns många inkubation ingår steg. Men det finns flera hållplatser möjligt som nämns i protokollet.
Protocol
Discussion
En procedur beskrivs hur man mest effektivt generera en stor Sätt fosmid bibliotek med genomiska DNA från ett kustnära vattenprov. Uppströms genomiska DNA-extraktion beskrivs i ett särskilt protokoll [3].
Som fosmid-biblioteket produktion är en flerstegsprocess-process, planera minst två till tre veckor i tiden för hela förfarandet inklusive alla fyra som presenteras steg. Utvinning av arvsmassans DNA är det mest avgörande steget och alla nedströms steg lita på kvalitet och kvan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka det kanadensiska institutet för innovation, British Columbia Kunskap utvecklingsfonden och Statens Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Kanada för att stödja pågående studier på låg syre regioner i kustnära och öppna hav vatten. MT och SL fick stöd av stipendier från Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution (CMDE). MT fick också gemenskap stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
Referências
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
