Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma
Summary
Nakli ile blastula veya gastrula aşamada hedef kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir adım-adım rehber.
Abstract
Karmaşık gelişim süreçlerini anlamak için kullanılan en güçlü araçlardan biri kimerik embriyoların analizidir. Chimera birden fazla hayvan hücreleri içeren bir organizma olarak tanımlanan mozaikler fazla bir genotip hücreleri genellikle yabani tip ve mutant, karışık olduğu bir tür kabus. Zebra balığı, kuruntulardan kolayca uygun embriyonik aşamada bir dizi embriyo bir donör embriyo hücrelerinin nakli yapılabilir. Etiketli donör hücreleri tek hücreli aşamada embriyo içine böyle bir floresan boya gibi bir soy işaretleyici, enjeksiyon yoluyla üretilir. Etiketli donör hücreler donör embriyolar kaldırılır ve bir bileşik veya diseksiyon mikroskop üzerine monte edilmiş bir yağ kontrollü cam pipet kullanarak etiketsiz ana embriyolara tanıtıldı. Donör hücreleri, bazı durumlarda, belirli bir bölge ya da gelişmekte olan blastula veya gastrula aşamada ana embriyo doku köklü kaderi haritalar dayalı ev sahibi embriyo nakli sitesi seçerek hedefli olabilir.
Protocol
Discussion
Transplantasyon hedeflenen kimeralar üretmek için kullanılabilir olan kolaylığı zebrafish omurgalı bir model olarak büyük güçlerin biridir. Yukarıda anlatılan bu protokol bir değişiklik Zigotik gelişiminde önemli rolleri olan genler için anne gen fonksiyonu analizi sağlar. Bu mutant balık yetişkinliğe kadar hayatta kalamaz bu yana, mutant hücreler "germline klonlar", bir başka vahşi tip konak embriyo mutant germline aktarmak için gereklidir. Yaratma germline mozaikler mutant bir donö…
Acknowledgements
Bu makalenin yazımı sırasında yararlı giriş için Moens laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. HK, Ulusal Sağlık Enstitüsü / NICHD hibe # 5R01HD037909-08 tarafından desteklenen post-doktora araştırmacısı. CBM Howard Hughes Tıp Enstitüsü ile bir araştırmacı.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
Referências
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
