Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform
Summary
Wir entwickelten eine neuartige Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung. Die Plattform ist in der Lage die Durchführung von bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel und wurde unter Verwendung eines neu entwickelten Makro / micro hybrid Herstellungsverfahren.
Abstract
Wir präsentieren ein neuartiges Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung, leiten kann bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel zur höheren Durchsatz. Wir entwickelten ein neues Herstellungsverfahren für Mikrofluidik-Geräte, die sowohl Mikro-und Makroebene Strukturen innerhalb des gleichen Geräts über einen einzigen Soft-Lithographie-Prozess zu schaffen, damit Massenfertigung mit guter Reproduzierbarkeit.
Die Multi-Kompartiment-mikrofluidischen Co-Kultur-Plattform besteht aus einem Soma Fach für Neuronen und sechs Axon / Glia Fächer für Oligodendrozyten (OLS) zusammen. Die Soma-Fach und Axon / Glia Kammern sind durch Anordnungen von angeschlossenen Axon-Führung Mikrokanäle, die als physische Barrieren zu neuronalen Soma in Soma Fach beschränken, während gleichzeitig Axone in Axon / Glia Fächer wachsen. OLs in Axon / Glia Fächer geladen werden können nur interagieren mit Axonen, aber nicht mit neuronalen Soma oder Dendriten, so dass lokalisierte Axon-Glia-Interaktion Studien. Die Mikrokanäle ebenfalls aktiviert fluidische Trennung zwischen Fächern, so dass sechs unabhängige Experimente auf einem einzigen Gerät für höheren Durchsatz durchgeführt werden.
Soft-Lithographie mit Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) ist eine häufig verwendete Technik in der biomedizinischen Bauelemente. Reservoirs auf diesen Geräten werden üblicherweise durch manuelles Stanzen definiert. Obwohl einfach, schlechte Ausrichtung und zeitaufwendig Natur des Prozesses macht diesen Prozess nicht geeignet, wenn eine große Anzahl von Stauseen immer wieder geschaffen werden müssen. Die neu entwickelte Methode nicht erforderlich manuelles Stanzen von Stauseen, die Überwindung dieser Beschränkungen. Erste, sieben Stauseen (Tiefe: 3,5 mm) wurden auf einem Poly (Methylmethacrylat) (PMMA)-Block mit einem Mikro-Fräsmaschine hergestellt. Dann wurden Arrays von Grat Mikrostrukturen auf einem Glassubstrat hergestellt, heißgeprägtem gegen den PMMA-Block, um Mikrokanäle, dass die Soma und Axon / Glia Fächer verbinden zu definieren. Dieser Prozess führte in Makro-Reservoirs (3,5 mm) und Mikro-Maßstab Kanäle (2,5 um) innerhalb eines einzigen PMMA Master übereinstimmen. Ein PDMS Replikat, das als eine Form Meister serviert wurde unter Verwendung von Soft-Lithographie und die endgültige PDMS Gerät wurde von diesem Master repliziert.
Primäre Neuronen aus E16-18 Ratten wurden auf die Soma-Fach geladen und kultiviert für zwei Wochen. Nach einer Woche der Zellkultur, überquerte Axone Mikrokanäle und bildete axonalen nur Netzwerk-Layer innerhalb Axon / Glia Fächern. Axone wuchsen gleichmäßig über sechs Axon / Glia Fächer und OLS aus P1-2 Ratten wurden Axon / Glia Fächern an 14 Tagen in vitro für Co-Kultur hinzugefügt.
Protocol
Discussion
Wir haben eine multi-Fach Co-Kultur-Plattform für das Studium Säuger-ZNS Axon-Glia-Interaktionen entwickelt. ZNS Axone wurden erfolgreich von neuronalen Zellkörpern / Dendriten isoliert und Oligodendrozyten wurden erfolgreich im Inneren des Gerätes co-kultiviert. Neuron Dichte kann von Anwendungen verändert werden, sondern zu niedrige oder zu hohe Konzentration kann dazu führen, Zellen zu sterben. Auch ist es wichtig, nur die Hälfte von Nährmedien, so dass die Zellen oder axonalen Schicht auf dem Substrat nicht …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) gewähren # 1R21MH085267 unterstützt.
Referências
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